生物工程技術金钱松.docVIP

生物工程技术在提高金钱松有效组分生产中关键技术研究 项目概述本项目首次将生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、转基因技术和细胞悬浮培养技术有机结合，在离体培养条件下，成功地诱导培育出金钱松有效组分含量高、生长速度快的悬浮培养体系并诱导出优良、安全性高的金钱松试管苗；进一步探明金钱松四倍体悬浮培养物、转基因培养物中有效成分的积累动态和时空分布规律及生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程，筛选出生产目标产物的内生菌并进行发酵培养，优化培养条件、发酵工艺，利用基因工程技术定向改变其生理过程，稳定、高效、安全的生产目标产物。最终实现工业化生产金钱松药用成分及抗生素的目的。并完成对培养物中各化学物质的提取、分离和纯化的工艺研究；最终实现大规模工业化生产金钱松土槿酸药物有效组分，极大地缓解金钱松药材市场的紧缺、种子丰产时间长对其大量繁殖的明显影响和更有效地保护金钱松野生植物资源。 项目研究主要目标、主要内容、技术关键、技术路线和应用方案。 1、主要目标： 采用组织培养、多倍体诱导、转基因及微生物发酵等多项生物工程技术，初步建立金钱松有效组分规模化快速繁殖细胞系和微生物发酵工程，为金钱松有效组分工业化快速生产及大量繁殖组培苗奠定基础。 2、 主要内容 （1）诱导金钱松幼苗 选用优良的金钱松种子在适宜的温度、水分、光照、促发剂等条件下，经过适当的预处理，分别通过土壤培养、培养皿培养以及无菌体系培养诱导其萌发，并采用均匀法筛选出金钱松中年种子萌发的最佳条件，并诱导成植株。 （2）建立金钱松无菌繁殖体系 选出生长健壮的金钱松幼苗，通过探讨其消毒条件、抗生素试验、最佳诱导分化培养基，建立金钱松愈伤组织无菌培养体系。 （3） 建立金钱松快速繁殖体系 筛选出有效组分含量高、适宜进行细胞悬浮培养的金钱松外植体；采用单因素试验和正交试验筛选出最佳培养基配方及培养条件，建立金钱松细胞悬浮培养体系。 （4）建立金钱松低温保存技术 为了保存金钱松的优良品质以及珍惜物种资源，从材料选择、材料预处理、冰冻保护剂、冰冻方法等的影响因素的探讨，建立高效的金钱松种质超低温保存技术。 （5）建立金钱松60Co-r射线诱导技术 采取60Co-r射线诱导技术诱导金钱松遗传基础的改变，通过改变酶活性等提高金钱松的有效成分含量及重新组合得到有利用价值的金钱松突变体，并对60Co-r射线不同的剂量和辐射时间长短来进行研究。 （6）建立金钱松多倍体诱导技术体系 为了明显提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，对金钱松不同外植体进行实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法的多倍体诱导以及对诱导后材料进行形态学鉴定和染色体核型鉴定试验。将培养的外植体和种子用不同浓度的秋水仙素在不同温度，光照等条件下处理不同时间并对所诱导的多倍体材料进行细胞染色体核型鉴定，筛选出诱导成功的金钱松多倍体组织和最佳诱导条件。 （7） 建立快速高产的金钱松多倍体悬浮培养体系 采用均匀法对金钱松多倍体愈伤组织的悬浮培养基本培养基MS、B5、SH、White等的筛选；培养基中激素配比、各种附加物、接种量、光照条件、碳源、氮源、pH值等因素对培养细胞的生长速度和有效组分含量的影响研究；对金钱松多倍体悬浮细胞进行细胞活力的测定，测定培养细胞的生长曲线。 （8）建立金钱松转基因体系 为了提高金钱松有效成分含量、生产速度以及新的药用成分的发现，采用农杆菌介导植物建立金钱松转基因体系并对诱导条件进行优化；对诱导后的材料进行PCR扩增实验选出转基因成功的材料，再对转基因成功的材料进行不定芽、不定根的诱导生产出转基因植株。 （9）建立金钱松发根生产体系 为了更快、更高质量的生产药物有效成分，将转基因诱导成功的发状根进行离体发酵培养，初步生产药物有效成分，优化生产条件，初步建立金钱松发根生产体系。 （10）多倍体及转基因培养产物成份累积及时空分布规律研究 采用动态采样检测的方法，应用HPLC等检测技术对金钱松四倍体悬浮培养物和离体培养的发根系中有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。 （11）建立金钱松内生菌培养体系 筛选优良金钱松外植体，培养、分离内生菌，通过不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳培养基和培养条件，建立金钱松内生菌培养体系。 （12）筛选、分离、鉴别金钱松内生菌 通过对金钱松内生菌的各种生物活性特性实验，筛选出能产生药物有效成分、抗生素类物质的目标菌种并运用微生物分离技术分离出目标菌种；运用微生物形态学、细胞学、基因工程学等技术鉴别其所属。 （13）建立产物特性菌种发酵培养体系 将分离、鉴别后合成目标代谢产物的菌种进行发酵培养，通过对不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳发酵工艺，并绘制微生物生长曲线，