用環磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型.docVIP

1 材料与方法 1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养 液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、 PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓 冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、 P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细 胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8 荧光抗体)。 1. 2 动物与分组 Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃ ，湿度60% ～ 80% 。 动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二: 测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和 CTX-2 组。 1. 3 实验方法和测定指标 1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的 CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给 予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。另 设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周 后测定各项免疫指标。 1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］ 动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行 测定，每管加入50μl 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。 1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］ 1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s 液洗2 次，每次离 心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬 液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。 1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生 长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于 15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃ 水浴 30min。用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮 P815 细胞，室温孵育15 ～ 20min 后，离心1 次。将P815 悬浮 于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 × 106 个/ ml，加0. 5ml 此悬液于含有脾细胞悬液的24 孔( 包括对照孔) 板中。37℃、5% CO2孵育5 天。5 天期间，每隔一天换一次液。 1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用 Hank’s 液洗1 次，200r /min 离心10min，收集细胞，重悬于 RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 × 107 / ml。用完全培养液配制3 个系列稀释的细胞悬液，每个稀释 度100μl，做3 个复孔。 1. 3. 3. 4 制备靶细胞离心处于对数生长期的P815 细胞， 重悬于0. 5ml Hank’s 液里，离心后重悬于RPMI1640 完全培 养液，调整细胞浓度为2 × 105 个/ml。 1. 3. 3. 5 CTL 检测按效应细胞和靶细胞比为100∶ 1、50∶ 1、 25∶ 1和12. 5∶ 1( 各加100μl) 在圆孔96 孔培养板的培养孔中 加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设3 个复孔。同时设靶 细胞自然释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液) 和最大 释放对