RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介.ppt

Invitrogen Proprietary Confidential Lentivirus Packaging pLP/VSV-G pLP1 pLenti6-GOI pLP2 Step 2: Viral rev protein exports the viral RNA genome (carrying the gene of interest) out of the nucleus. Envelope protein is made and becomes studded in the cell’s membrane. pLP1 and pLP2 make gag/pol and rev. In the nucleus, Pol transcribes pLenti into viral RNA (5’ LTR-3’ LTR). Rev transports the viral RNA w/ goi from nucleus to cytoplasm. Rev recognizes the viral RNA via its RRE (Rev response element). Rev goi goi Rev Gag Pol Envelope protein Invitrogen Proprietary Confidential Step 3: Viral gag proteins package the gene of interest and infectious viral particles bud out of the cell. In the cytoplasm, viral RNA (goi) is combined with the Pol protein. This packaged complex goes to the plasma membrane and buds off, picking up the envelope on its way out (pseudotyping). Gag Pol Lentivirus Packaging Invitrogen Proprietary Confidential Lentivirus Packaging Step 4: The supernatant is collected and titered. The viral particles created are replication incompetent viral particles that are capable of stably delivering a gene of interest. Invitrogen慢病毒侵染细胞实例一 慢病毒侵染原代细胞-子宫平滑肌瘤细胞的荧光和明视野照片对照 Invitrogen慢病毒侵染细胞实例二 慢病毒侵染一种干细胞(荧光和明视野照片对照) 慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照) | Life Technologies Proprietary Confidential | * 慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照) Invitrogen慢病毒侵染细胞实例三 慢病毒滴度测定 * 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5 * 诺百优势 质量保证：如无特殊要求我们将提供至少1 ml含107-108病毒颗粒的病毒液。 去除了病毒的关键蛋白，对人体安全；属于复制缺陷型病毒，不会产生下一代病毒颗粒；已被改造为自身失活性，病毒转导并整合到细胞后不再具有产生具有包装能力的病毒基因组。可根据需要选择组织特异性或细胞特异性启动子 * 客户提供：含有目标基因的质粒（提供测序图谱）或所要表达的目的基因的名称，序列；所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化；若需要检测外源基因的表达，如需要请提供相应的抗体 我们提供：提供重组后的慢病毒载体质粒，并附上对目的基因的PCR鉴定结果；提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液 * 第三部分 哺乳动物稳定转染细胞系构建服务 * 稳定转染 最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin） 稳转优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 * 诺百优势 质量保证：可对转染细胞的外源基因表达进行严格鉴定，包括RNA水平和蛋白水平（rt-PCR,免疫蛋白印迹） 筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆：质粒DNA整合到染色体上；可使用慢病毒载体转导的实验条件，整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基