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人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因治疗 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; nbsp;作者：曾赵军，胡维新，李子博，罗赛群 【摘要】nbsp; 目的 探讨Tet调控下体外抗生素诱导基因治疗人乳腺癌裸鼠移植瘤的可行性。方法 构建人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型, 制备有感染活性的重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk与RevTetOn。 观察体外强力霉素（Dox）诱导, 丙氧鸟苷（GCV）和逆转录病毒作用后移植瘤生长的变化及组织病理改变, 分析其对乳腺癌裸鼠移植瘤的调控性治疗作用。结果 乳腺癌裸鼠治疗后，肿瘤体积明显减小，生长受抑，生存周期延长, 组间比较有显著性差异（Plt;0.05）。瘤体HE染色显示治疗组肿瘤局部有炎性细胞浸润和强嗜酸性细胞。RTPCR结果显示Dox诱导后瘤体组织HSVtk表达较明显。结论 通过逆转录病毒介导Tet调控，可以在体外抗生素Dox诱导下对人乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行基因治疗，杀伤肿瘤细胞。 【关键词】nbsp; 乳腺癌；基因治疗；裸鼠；逆转录病毒；基因调控 基金项目：美国中华医学会（CMB）基金资助项目（# 99698） nbsp;nbsp;nbsp; Key words：Breast cancer；Gene Therapy；BALB/C mice；Retrovirus；Antibiotic nbsp;nbsp;nbsp; 自杀基因治疗是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)在体细胞内能将无毒的药物前体GCV代谢为有毒物质，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤［1］。本实验用含有调控因子TetOn和HSVtk基因的重组逆转录病毒与底物GCV处理后,在体外强力霉素作用下观察对人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型肿瘤生长、瘤体大小以及肿瘤组织病理学等改变,分析肿瘤组织内HSVtk基因表达的变化。以探讨在体外抗生素诱导下, 自杀基因对乳腺癌细胞株MCF7移植的乳腺癌裸鼠的体外调控性治疗作用。 nbsp;nbsp;nbsp; 1nbsp; 材料与方法 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1nbsp; 材料 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.1nbsp; 细胞与动物nbsp; 人乳腺癌细胞株MCF7、PA317、NIH3T3来自中南大学湘雅医学院细胞中心。年龄4周的雌性BALB/c裸鼠（nu/ nu）购于中国医学科学院上海实验动物中心。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.2nbsp; 主要试剂和质粒nbsp; 质粒载体pRevTRE、pRevTetOn购自美国Clontech公司，质粒pGEM7Ztk由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所曹亚教授惠赠。pRevTRE/HSVtk由本中心构建［2］，含有四环素反应元件（TRE）和自杀基因HSVtk。限制性内切酶购自Roche公司和Promega公司。G418、潮霉素、DMEM、0.25%胰蛋白酶、RNATRIzol 试剂盒均购自Gibco BRL公司。GCV、Dox购自美国Sigma公司。其余试剂购自Sigma公司。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2nbsp; 逆转录病毒的制备、纯化与滴度测定 nbsp;nbsp;nbsp; 通过改进的“微乒乓感染法”将质粒逆转录病毒载体导入包装细胞PA317中，以潮霉素B或 G418筛选克隆细胞，浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒［3］。得到病毒后纯化并测定其滴度。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.3nbsp; BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立、分组和干预方法 nbsp;nbsp;nbsp; 模型的构建：取对数生长期的MCF7细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2遍，离心1 000r/min 4min，无血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数使细胞密度达2×106/ml，以0.2ml细胞悬液注射接种于BALB/c裸鼠左侧近前腋处皮下并作好标记。细胞接种后，观测裸鼠生长状况。 nbsp;nbsp;nbsp; 动物分组和干预：待裸鼠皮下肿瘤长至0.7～0.8cm后，按随机数字表法将裸鼠随机分为4组，即培养基DMEM组、GCV+病毒组、GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组，每组8只，苦味酸标记。 GCV+病毒组、Dox+GCV+病毒治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射病毒悬液，病毒滴度为1×106 CFU/ml，每周2次，连续2周。同时注射病毒悬液第2周开始GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射Dox 0.1ml（100mg/kg），连续7d。DMEM组给予腹腔注射DM