稀有人參皂苷IH901酶法转化与制备研究.docVIP

稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究 摘　要:本研究利用酶制剂蜗牛酶,酶法转化三七二醇组皂苷制备稀有人参皂苷IH901,正交实验优化酶解条件,建立酶法转化工艺。结果表明:超声法提取三七总皂苷正交实验优化条件为用75%乙醇溶液, 15倍溶剂用量,超声波提取210min作为最佳条件,三七总皂苷得率为12. 21%;酶法转化二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷IH901,正交实验优化的条件为物料比为6/1、反应时间9 h、反应温度为45℃、pH值为3. 0,酶解得率为54124%;经硅胶柱分离获得IH901单体化合物,HPLC测定纯度达98%。酶法转化制备皂苷IH901的工艺方法简便,切实可行,可为中试生产提供参考。 关键词:二醇组人参皂苷;酶法转化;稀有人参皂苷IH901 三七为五加科人参属植物(Panax notoginseng(Burk) F. H. Chen),人参皂苷是三七的主要有效成分,其中二醇组人参皂苷含量占大部分。人参皂苷长期以来是人参类药材药理药效学研究的热点,近年来研究表明天然二醇组人参皂苷如Rb1、Rb2 等口服后由肠道细菌所分泌的糖苷酶选择性水解C23位糖配体,生成仅在C220位保留一个葡萄糖的次生皂苷,称为稀有人参皂苷IH901(CompoundK,人参皂苷M1) (图1)。IH901被认为是二醇组人参皂苷的最终药用活性形式,在抗肿瘤、抗衰老,抗炎症等方面均表现较高活性。鉴于IH901药物的应用前景,目前制备人参皂苷IH901的研究备受关注,由于其是肠道菌代谢的产物,在自然界不存在而无法从人参类药材中直接分离获得,主要通过微生物发酵转化和酶法转化的方法将人参皂苷在体外进行改造获得,其研究目标主要锁定在对人参二醇型皂苷C23和C220位的糖基结构修饰,即利用生物修饰方法进行人参皂苷糖基改造,使人参、西洋参中含量较高的二醇型人参皂苷Rb, Rc,Rd等的糖基经过水解作用,定向转化为稀有人参皂苷IH901。本文通过植物化学方法,研究从三七中获得二醇组皂苷酶解原料,利用酶制剂蜗牛酶转化制备稀有人参皂苷IH901,正交试验优化酶解反应条件,最终确定利用三七二醇组皂苷体外酶转化法制备稀有人参皂苷IH901的工艺流程。 材料与方法 1.1 实验材料 三七药材购自厦门光华大药房,对照品人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1 购自中国药品生物制品检定所;对照品人参皂苷IH901由山东省天然药物工程技术研究中心提供(纯度大于98%); 蜗牛酶(snailase)、柚皮苷酶(naringinase)和木聚糖酶(xyla2nase)购自SigmaChemical Co;果胶酶(Pectolase)和纤维素酶(Cellulase)购自Yakult of Japan;β2葡聚糖 苷酶(β2glucanase)购自Fluka 1. 2　仪器与试剂 旋转蒸发仪(EyelaCorporation);紫外分光光度计(上海UnicoUV22802H);冷冻干燥机(Thermo,Modul Yod2230);液相色谱仪(Agilent 1100);核磁共振仪(AV2400BrukerBioSpin);乙腈购自merck公司,其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 1. 3　实验方法 1. 3. 1　超声波法提取三七总皂苷 称取三七粉末样品,加入10倍量95%乙醇,超声提取60min,抽滤,滤液减压浓缩成浸膏,加少量的超纯水溶解,用乙醚脱脂脱色后,正丁醇多次萃取获得三七总皂苷;为优化提取条件,称取9份20g样品,选定对提取率影响较大的溶剂用量、超声时间和乙醇浓度作为考察因素,每个因素取3个水平,按照三因素三水平正交设计进行正交试验,考察不同因素对总皂苷提取的影响,确定三七总皂苷最佳提取条件。 1. 3. 2　硅胶柱分离制备二醇组皂苷 硅胶G(200～300目)于110℃活化60min,湿法装柱,三七总皂苷用少量洗脱剂CHCl3: n2BuOH:MeOH: H2O(20: 40: 15: 20下层)溶解,上样于硅胶柱介质顶部;用洗脱剂冲洗,等量收集;用薄层层析鉴定收集洗脱液,合并相同组份,减压浓缩,冻干备用。 1. 3. 3　酶法转化制备稀有人参皂苷IH901 1. 3. 3. 1　最佳转化酶的筛选 　　选用果胶酶、纤维素酶、蜗牛酶、β2葡聚糖苷酶、柚皮苷酶和木聚糖酶6种酶作为筛选对象;二醇组皂苷与酶以物料比8: 1溶解于pH4. 6的磷酸2柠檬酸缓冲液中;在40℃恒温水浴中反应24、48、72、96h,每隔24h取各实验组离心管;终止反应,加入正丁醇溶液分三次萃取,萃取液浓缩用甲醇溶解定容;通过TLC检测不同酶解反应时间内的酶解产物,根据TLC的斑点和颜色深浅判定酶解产物,比较不同酶的酶解作用大小。 1. 3. 3. 2　酶法转化的正交优化