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研究生授课资料 张煦 第一部分 免疫组织化学技术 一、免疫组化技术（Immunohistochemistry techniques） （一）定义：是应用抗原与相应抗体接触后可形成抗原－抗体复合物的化学反应，以检测组织或细胞内抗原或抗体的技术。又称免疫组织化学技术（Immunocytochemistry techniques） 1、免疫组化与组织化学（histochemistry） 组织化学与免疫组化的区别 组织化学显示各种不同的化学成分往往需要用各种不同的方法和条件，既烦琐又不甚敏感，有很大的局限性。而免疫组化则不然，虽然程序繁杂，但用一种基本方法能够检测定位许多组织成分，如：各种蛋白质、多肽、酶、激素，甚至多糖和脂质成分等都可以用免疫组化方法进行检测。 免疫组化是组织化学的一个分支。组织化学是在细胞和组织中以化学和物理的实验方法对某些特殊物质、反应基因和酶促活性进行识别、定位和定量。即组织化学技术是通过分解、置换、氧化、还原等化学变化，经呈色反应显示组织细胞内的化学成分的方法。免疫组化则是利用免疫学的抗原、抗体具有特异性结合的原理，检测组织细胞中的化学成分或化学性质。 2、免疫组化与亲合组织化学（affinity histochemistry） Bayer（1976）将这种利用两种物质之间的高度亲合力的进行的组织化学检测称为亲合组织化学。虽有人认为它们是免疫组化的进一步发展，但亲合物质之间的反应并不是抗原与抗体的反应。从抗原与抗体互相亲合来看，免疫组化倒应包括在亲合组织化学之中。随着亲合组织化学的发展，一些亲合物质又被引入免疫组化，使两种组织化学技术融合为一种方法，明显提高了组织化学定位的准确性和敏感性。 近20多年来，相继发现了多种亲合物质，如：植物凝集素（Lectins）与糖结合物（glycol conjugates）、葡萄球菌A蛋白（staphylococal proteinA）与IgG、生物素（biotin）与卵白素（avidin）、激素（脂质）与受体等。这些物质是一些有双价或多价结合能力的物质，不但亲合物质之间有高度亲合力，而且可以与标记物如：荧光素、酶、同位素、铁蛋白等相结合。 3、免疫组化与免疫病理（immunologic pathology） 广义的免疫病理学则研究所有疾病及病变发展中的免疫学机理问题。免疫病理的研究中，免疫组化技术的确占重要位置，它可以确定组织内抗体、补体、抗原，并识别淋巴细胞亚群，但免疫病理的研究方法还包括其他免疫学方法及一些非免疫学方法。另一方面，免疫组化可以识别与免疫病理无关的其他许多抗原，如：病毒、酶、激素等。可见免疫组化与免疫病理既有密切联系，又有明显区别，既有交叉又有独立的内容。 4、免疫细胞化学与原位杂交免疫细胞化学（In situ hybridization immunocytochemistry） 分子杂交与免疫组织化学的结合，形成了在细胞、亚细胞和分子水平同时检测基因及其表达产物的完整体系，把基因探针（基因工程）和单克隆抗体技术结合起来，成为当代生物科学和医学在分子水平研究和诊断的新兴技术。尤其是近年来与PCR技术结合的原位PCR技术，敏感性很高，包括分子生物学基础理论、核酸分子探针制备、原位分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、核酸分子杂交电镜技术、杂交与免疫细胞化学双标记技术、分子杂交在染色体制片的应用和分子杂交基因诊断的应用等方面。 （三）免疫组化技术的特点 1、高度的特异性、可达到单个AA水平。 2、敏感性高。 3、方法、步骤统一。 4、形态、机能、代谢的完美结合（定性、定位、定量）。 （四）免疫组化技术全过程 1、抗原提取（纯化）（粉碎、沉淀、层析、离心、电泳） 2、抗体制备： PcAb：用Ag免疫动物产生Ab，由于Ag有多个决定簇，刺激多个B细胞克隆，产生针对多个Ag决定簇的混合物（多价Ab）。 McAb：用杂交瘤技术，在细胞培养条件下，经过多次克隆化，使一个杂交细胞及其后代产生一种均质的Ab。（分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性） 3、抗体纯化：除去抗血清中的其他白蛋白，α、β球蛋白以及纤维蛋白。（目的：Ab标记时，免受其他蛋白的干扰） 4、标记抗体：Marrack于1934年提出了在Ab分子上结合适当的标记物，用以识别其相应抗原的设想。 5、细胞和组织切片标本的制备。 6、免疫组化反应和显色。 7、观察和分析结果。 Marker种类：荧光色素、酶、金、铁蛋白、放射性同位素、血浆蛋白、多聚微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌体。 （五）ABC法和PAP法免疫酶标记步骤 1、石蜡切片，二甲苯脱蜡三次。 2、经100%、95%、80%酒精、蒸馏水水化。 3、阻断内源性HRP：0.3%H202甲醇液，室温20分钟，PBS冲洗3x5’。