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细胞毒活疫苗（灭活疫苗）生产工艺课件豪威生物科技有限公司主讲人乔云龙细胞苗工艺流程图种毒细胞 1、原代细胞：牛睾丸细胞、鸡成纤维细胞、羊睾丸细胞传代细胞：wero非洲绿猴肾细胞、MDCK狗肾、DF-1鸡胚成纤维细胞、BHK-21幼仓鼠肾细胞、ST猪睾丸细胞、PK-15猪肾上皮细胞、Marc145猴肾细胞。三、细胞培养液主要成分氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡.因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺.碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖，核糖，脱氧核糖，丙酮酸钠和醋酸等.无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素，细胞通常可耐受260mOsm/kg 320 mOsm/kg.标准培养液的渗透压在此范围内波动.特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质.缓冲系统大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是，细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH （7.4 - 7.7），而传代转化细胞系则需要偏酸pH （7.0 - 7.4）.由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2体系进行缓冲，因此，气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%，培养3液中NaHCO3的加入量为1.97g/L；如果CO2浓度维持在10%，培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L.细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换. HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加.在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色.磷酸缓冲液磷酸盐缓冲液是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，其中磷酸二氢钠酸性较强。如果血液中的ph值过高的话，多余的碱就会与酸磷酸二氢钠结合生成磷酸氢二钠，反之，过酸时就会与磷酸氢二钠反应产生磷酸二氢钠，确保ph值就会稳定在一定的范围内。维生素在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长.DMEMDMEM(A) 细胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1无水氯化钙 .2H 2 O265.0018L-丝氨酸42.002硝酸铁 .9H 2 O0.1019L-苏氨酸95.003氯化钾400.0020L-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6721L-酪氨酸72.005氯化钠6400.0022L-缬氨酸94.006无水磷酸二氢钠109.0023D-泛酸钙4.007丁二酸75.0024酒石酸胆碱7.208丁二酸钠100.0025叶酸4.009L-盐酸精氨酸84.0026肌醇7.2010L-盐酸胱氨酸63.0027烟酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黄素0.4012L-盐酸组氨酸42.0029盐酸硫胺4.0013L-异亮氨酸105.0030盐酸吡哆辛4.0014L-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015L-盐酸赖氨酸146.0032丙酮酸钠110.0016L-甲硫氨酸30.0033酚红9.30.0017L-苯丙氨酸66.00其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me 对细胞生长有很重要的作用.有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用.同时避免过氧化物对培养细胞的损害.另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞.2-Me是一种小分子还原剂，极易氧化.分