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关于染菌问题 a 常见的多为真菌感染,细胞瓶内可见白色菌丝。一旦出现此种情况,需要立刻丢弃细胞瓶。孵箱内重新进行灭菌处理 b 常见细菌感染 如杆菌 球菌 支原体等 c 最近实验室出现黑胶虫染菌现象 对于“黑胶虫”的处理方法:首先,血清买回来灭活前冻融应逐级冻融,即按照-20℃——4℃完全融化后,再置入水浴中,与室温一起升高到56度,这样的目的是避免温度骤变,导致血清中的营养物质丧失活性。 第二,血清灭活后分装保存。按照每次用血清的量分装,尽量减少血清冻融的次数。分装时注意无_ 第三,细胞培养时血清浓度稍大一些。通常细胞培养血清浓度为10%-15%,但如果血清冻融次数过多,那营养物质丧失活性,按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分,故培养基配置时一般用18%-20%的血清。 4 关于细胞冻存 a 10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培养基 b 4℃,40分钟;-20 ℃,30分钟;-80 ℃ ,24h后液氮罐保存 c 如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四度冰箱(因为DMSO放热,刚加进去和容易损伤细胞,常温DMSO对细胞毒性也大。) d 冻存的原则是慢冻快苏 关于荧光染色 实验步骤1 细胞取出固定2h后,也可4℃保存多日后一起染色 2 将孔板内固定液(2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛)吸出,用PBS清洗3次,每次5分钟 3 用triton脱细胞液( 0.1%浓度)包被样品5分钟,目的是增加细胞通透性,后用PBS清洗3次 BSA 封闭液封闭(具体看抗体的种属来选择包被液) 37℃ 4h ,也可以4℃过夜 Ⅰ抗 30um/well即可 ,37℃ 30分钟 取出样品清洗3次,每次5分钟,加一次封闭30分钟 加荧光Ⅱ抗 (需避光) 30um/well 37℃ 30分钟 注意:此步骤不用清洗 上清液吸干 ,加DAPI(40ng/ml)浓度较好 4分钟即可 清洗5次 荧光拍照 注 :细胞染色有多重方法,本实验仅是抗-α-actin染色实验。其他染色方法有很多相近之处 本总结有许多不足之处,需要不断完善,制 定统一实验方法 做流式检测,一般阳性指标可以检测CD73,29,105,阴性指标可以检测34,45等。阳性 细胞活力取决于很多因素,例如大鼠的年龄,体外分离的时间,是否有酒精的污染,胎牛血清的浓度,换液技巧等。推荐用15-20%FBS,头24小时后换液指标大于95%,阴性指标小于5%,比较纯 细胞如果低密度长期培养,容易出现老化,分化 目前实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结 几种细胞实验步骤 EC原代的培养 实验前准备 器械 消化酶 M199培养基 其他 大号止血钳10把,肾形盘2个,圆头不锈钢针头若干,细胞培养瓶若干,50ml离心管若干,大号组织剪2把,弯镊1把,弯头组织剪1把,酒精棉球若干,巴氏吸管若干,胶头若干 二型胶原酶(1mg/ml) 胰酶Try(2.5mg/ml) M199培养原液85ml FBS 15ml L-Glu 1ml浓度为200mmol/L ECGS 1ml浓度为15-20ng/ml 离心液 细胞培养瓶 NS. 人脐带纵剖面和直观图 实验操作步骤 将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净工作台内(超净工作台内事先UV灭菌) 注意:紫外灭菌时应关闭日光灯,送风机,人员要离开生化间,20分钟后返回关闭紫外灯,打开日光灯,风机。5分钟后进行实验 打开NS. ,点燃酒精灯(不建议使用),将酒精棉铺开在操作台中央,方便将所有器械和瓶盖的摆放。 3 将半月盘内倒入少许无菌NS.,取出新鲜脐带轻轻放入半月盘内,用灭菌后的脱脂棉球将脐带外周的血迹擦干,将脐带两端血迹擦干以便暴露静脉血管。将圆头不锈钢针头轻缓的插入两端静脉血管内,并顺势用止血钳夹死固定。注意:本实验操作时要戴好橡胶手套,操作前进行医用酒精擦拭消毒,当脐带过短时,只要一端插入圆头针,另一端用止血钳夹死。 用无菌NS.,将脐带静脉血管内的淤血冲洗干净,直到冲出的NS.无色为止,接着将血管内的空气抽空,两端固定。 5 将Ⅱ型胶原酶注入脐带静脉血管内,此步骤操作时,注意两端的注射器要来回做活塞运动以便使血管内壁与Ⅱ型胶原酶充分接触,注入的Ⅱ型胶原酶比例为8ml/15cm。注意:一般本步消化时间为10分钟左右, Ⅱ型胶原酶的温度保证在37℃左右消化能力最好。特别提醒的是在消化过程中要用手来回揉搓脐带外壁,有助于内皮细胞的脱落,此细节至关
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