醫用分子生物学讨论课基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳RNA提取.pptVIP

3 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 人类细胞质RNA提取 即逆转录PCR，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR的原理、方法 RT-PCR原理 principle 3 RT-PCR的原理、方法 RT-PCR方法 method 3 提取总 RNA 合成 cDNA PCR 分子生物学讨论课汇报展示 第五小组 1 人类基因组DNA提取 2 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 3 琼脂糖凝胶电泳结果分析（DNA） 4 琼脂糖凝胶电泳的应用(DNA) 5 人类细胞质RNA提取 6 RT-PCR的原理、方法 7 琼脂糖凝胶电泳结果分析(RNA) 8 琼脂糖凝胶电泳的应用(RNA) 目录 人类基因组DNA提取 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 汇报人： 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA， 除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的 材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细 胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细 胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采 集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产 前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛 膜细胞 SDS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质 膜； 蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类 和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA 一同沉淀下来，干扰酶的活性，消化后需 要用酚、氯仿抽提纯化； 人类基因组DNA提取 原理 principle 1 酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在 其中； （加入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细 胞降解物而纯化DNA，可以避免酚的污染。） 氯仿也是一种有效的蛋白变性剂，它还能促进两 相的分离； DNA上清溶液再经氯仿抽提后用乙醇沉淀，分离 纯化的DNA。 人类基因组DNA提取 原理 principle 1 人类基因组DNA提取 1 提取 方法 从全血中提取 1 2 从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取 人类基因组DNA提取 1 操作方法（全血） 点细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化 　　1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。 　　2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。 人类基因组DNA提取 1 DNA与吸附柱的结合操作 3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。 人类基因组DNA提取 1 DNA的纯化操作 4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。 5．重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。 6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。 7．取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。 无水乙醇沉淀时可见白色絮状物 0.8%琼脂糖凝聚电泳可见一基因组DNA条带 OD值测定 人类基因组DNA提取 实验结果 experimental result 1 饱和酚吸取时记得吸取下层的有机相 乙醇沉淀时，要沿离心管壁向DNA溶液中加入无水乙醇，轻轻摇动离心管混合至体系完全均一，见白色絮状DNA 收集细胞的多少是实验成功与否的关键 沉淀中加入1mlSTE后，打散细胞团便于充分消化细胞 人类基因组DNA提取 注意事项 matters needing attention 1 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 1 定义 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 进