蛋白质定位幻灯片.pptVIP

第三章蛋白质定位的方法 第二节细胞器分离结合免疫印迹法定位蛋白 本节课的主要内容 蛋白质的定位 细胞器的分离 免疫印迹法 具体的实验实例 蛋白质定位 无论原核还是真核细胞都有一个高度有序的结构，新生的蛋白质都要被准确的运送到细胞的各个部分，如溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞质和细胞核等，以更新其结构组成和维持其功能，这一过程称为蛋白质的定位。 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。 细胞根据蛋白质是否携带分选信号以及分选信号的特征，选择性地将各种蛋白质送到细胞不同部位。根据蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。 细胞内蛋白质的分选和运输对于维持细胞的正常结构与功能、完成各种生命活动非常重要，在许多情况下，蛋白质的异常转位与细胞的病例变化密切相关。 蛋白质定位 蛋白质的亚细胞定位常用方法： 差速离心、密度梯度离心法；免疫胶体金标记；免疫荧光；免疫印迹法；与GFP构建融合基因表达融合蛋白； 细胞器的分离技术 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据 物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同， 而使物质分离的分离分析技术。 细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结 构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在 同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯 度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器 差速离心： 采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。  密度梯度离心法： 差速离心法 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是： ①分离效果差，不能一次得到纯颗粒； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。 密度梯度离心法 该法的优点是： ①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒； ③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。? 部分细胞器的分离方法 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。 1.细胞膜的分离 ?细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指定区域，可分离得到纯制品 2.线粒体的分离 ?线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。 3.线粒体膜分离 ?线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心 4.聚核糖体的分离 ?核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。 5.微粒体分离 ?微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。 免疫印迹法和差速离心法研究蛋白质定位 免疫印迹法（immunoblotting test,IBT),也被称为蛋白质印迹法（Western blotting)。对已知蛋白质的表达，可用一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过构建融合蛋白，对所带标签的抗体进行检测。差速离心法是交替使用低速和高速进行离心，用不同强度离心力使不同质量的物质分级分离的方法，尤其适用于混合样品中沉降系数差别较大组分的分离。差速离心法结合蛋白质印迹法，可观察到蛋白质在各亚细胞结构中的分布，这也是目前比较常用的、比较准确的蛋白质定位研究方法。 蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析 Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 Western Blot 简介： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质