《精》植物生理实验二.ppt

实验二 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 硝酸还原酶（nitrate reductase，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。 二、原理 在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酸胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐（或α-萘胺）生成红色偶氮化合物，可在520nm下比色测定。反应如下： 离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2-并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。 活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。 三、实验材料、仪器和试剂 1．材料 材料可选用小麦、玉米、白菜、油菜、烟叶等作物的叶片 2．仪器 （1）天平（2）真空泵和真空干燥器（3）离心机（4）20mL试管×7（5）50mL三角瓶×3（6）恒温水浴（7）恒温箱（8）分光光度计（9）移液管：5mL×2；2mL×5；1mL×1 3．试剂 （1）亚硝酸钠标准液： （2）0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液： A液（0.2mol/L Na2HPO4） B液（0.2mol/L NaH2PO4） 取A液84.0mL和B液16.0mL，混匀，加蒸馏水100mL。 （3）0.04mol/L KNO3： （4）1%对氨基苯磺酸： （5）0.2% α?萘胺： （6）30%三氯乙酸： 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 取6支干净试管，编号，按表1加入试剂：摇匀后在室温下放置30min，然后在520nm波长下测定光密度，以亚硝酸含量和光密度值绘制标准曲线。 2．酶反应和酶活性的测定 将实验材料用水洗净，再用蒸馏水冲洗，然后用纱布或滤纸吸干。将材料剪成0.5cm × 0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取三份，每份0.4g，然后分别放入3只50mL的三角瓶中，编号后按表2加入各种试剂： 摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气10-15min。放气后叶片变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒温箱，在30℃、暗条件下保温30min。取出后立即向2、3号瓶分别加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。 将各瓶中的反应液离心（2 000r/min，10min）（根据情况，可以省略），然后分别吸取上清液1mL于另一试管中，各加入2mL 1%对氨基苯磺酸和2mL 0.2% α-萘胺（注意顺序），室温显色30min后测定520nm波长下的光密度。用2、3号管溶液光密度平均值减去1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（μg）。 五、结果与计算 把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入下式，计算硝酸还原酶活性： 六、思考题 1．为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气？ 2．为什么1号三角瓶在加入样品之前就要先加入1.0ml 30%三氯乙酸？ * * 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 0.2% α ?萘胺 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1%对氨基苯磺酸 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 亚硝酸钠标准液（mL） 6 5 4 3 2 1 试剂 试管号 亚硝酸钠含量（μg ）0 1 2 3 4 5 表一标准曲线制作取样表