【2017年整理】973蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究.doc

项目名称： 肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究 徐平 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 2011.1至2015.8 总后勤部卫生部   三、研究方案 1．学术思路 本项目立足于我国重大肝病的国情，意图在原有肝脏蛋白质组学和大规模表达谱、翻译后修饰谱研究的基础上，选择研究基础好、与肝病发生发展和状态特征关系密切的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化展开研究。在改进基于质谱的磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白高通量的定性和定量研究技术的基础上，结合已经建立的系列肝病相关的细胞、动物模型和临床标本，系统研究与肝病发生发展相关的蛋白质及其异质体的动态表达差异、调控规律和翻译后修饰信号识别的分子机制，进而揭示蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰与肝病关联的生理病理学意义。本研究项目需要蛋白质组学、生物信息学、遗传学、生物化学、基因组学、分析化学和糖生物学等各交叉学科团队的通力合作，而其产生的科研成果又将施惠于各个研究领域。 2．技术途径 本课题的技术途径包括肝病蛋白质及其翻译后修饰体差异的发现、差异相关的调控途径和网络研究以及重要功能蛋白的功能表征等3个层面的多种途径。 1）蛋白质及翻译后修饰体差异谱的产生技术：改进已有的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化鉴定、定量技术，结合我国在系列肝病模型和疾病标本方面的良好积累，利用代谢过程标记技术产生的重稳定性同位素完全标记蛋白质组为定量内标，进行多维LC-MS/MS或GeLC-MS/MS的蛋白质及其修饰异质体的定性鉴定和定量分析。对发现的差异利用可视化蛋白质及其修饰体差异显示技术等假阳性排除技术进行数据过滤，并用质谱多反应监测技术（MRM）进行验证。 2）参与蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化调控的酶学机制和信号途径研究：利用基因敲除、基因敲入细胞株、肝病细胞或小鼠模型，结合代谢过程标记的重稳定性同位素标记内标和基于MRM的翻译后修饰酶系目标导向定量蛋白质组技术，巧妙避开复杂蛋白质组样品和当前仍然有限的蛋白质组学鉴定能力之间的矛盾，定量比较、建立肝病相关翻译后修饰调控的信号途径。 3）重要功能蛋白的表征研究：利用分子生物学技术，在体外生化反应体系、基因工程细胞和小鼠模型进行重要肝病相关蛋白的功能验证和分子生物学机理探索。 3．创新性和特色 本课题的创新之处集中表现在： 首次围绕重大肝病进行多个蛋白质翻译后修饰系统研究，有利于发现不同修饰间的交互影响，阐明翻译后修饰相关的肝病病理生理机制； 发挥我国在肝病模型和标本方面的积累和优势，注重重大疾病相关生物学问题的解决，变经典的定性数据积累型蛋白质组学研究模式为假设驱动型定量蛋白质组学研究； 不仅在组学水平系统调查蛋白质及其翻译后修饰异质体在肝病发生发展转移过程中的质和量的变化，而且监测影响这些变化的翻译后修饰酶学决定机制，便于计算生物学和生物信息学技术的整合，并形成肝病相关蛋白质翻译后修饰系统生物学研究模式阐明肝病的本质； 系统集成和发展蛋白质翻译后修饰研究的系列关键技术，解决蛋白质泛素化和糖基化修饰鉴定的国际性难题。 本课题的特色在于： 目标清晰，着眼于我国重大肝病的国情，问题明确，注重阐明翻译后修饰相关的肝病机理； 方法新颖，立足于建立系统的蛋白质翻译后修饰的位点、种类、化学计量及翻译后修饰相关酶的规模化、高精度的定量动态化研究技术，假阳性排除技术、分析策略和生物信息学整合途径，着眼于这些研究成果在我国高发的肝病，特别是肝癌的发生、发展过程中亟需解决的问题上的应用，结论于临床医学对实验基础科学分析结果的严格验证，研究内容间环环相扣； 集群效应突出，组合我国在分析化学、蛋白质组学、细胞生物学和生物信息学优秀团队，充分发挥各团队的专长开展相关研究。 4．取得重大突破的可行性分析 本项目瞄准了当前蛋白质组学研究的热点、重点、难点问题和国家急需，充分利用项目组在研究队伍、研究资源和技术上的优势进行联合攻关。 资源优势： 项目参与单位已经积累了本项目研究所需的肝癌细胞系（包括不转移和具有不同转移潜能的肝癌细胞）、肝病的基因敲入、敲除细胞株和小鼠模型、肝癌高发现场以及正常人和早、中、晚期肝癌患者及相关肝病的组织和血清标本库，具有广泛的样本积累。这为肝病相关蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化的系统研究提供了资源保证。 技术优势： 本项目试图整合蛋白质翻译后修饰蛋白质组学技术和定量蛋白质组学技术，结合肝病发生发展各阶段的生物学模型，系统考察蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化在肝病病因、进程以及预后中的作用、变化规律和调节机制。在深入研究疾病相关翻译后修饰及其调控的信号途径的基础上，结合目标导向的定量蛋白质组学技术系统地筛选和发现肝病相关的翻译后修饰蛋白及其调控的信号途径。项目的研究思路新、基础实。参加本项目的