【2017年整理】Ge 免疫组织化学染色技术.docVIP

Mallory三色染色法： 染料试剂：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红、重铬酸钾、磷钨酸、醋酸 免疫组织化学的主要染色方法 第一篇 概述 免疫组织化学染色法： 免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。 染色注意事项：/detail-68.html 一、直接法 二、间接法 三、未标记抗体法 抗体和酶、荧光素结合后，或多或少的降低了抗体与抗原的结合能力。 有酶桥法和PAP法，但前者弊端较多。 PAP法（Peroxidase Antiperoxidase. PAP) PAP复合物（二分子抗体，三分子酶），体积小，稳定，穿透性好 特点：较间接法敏感20~100倍，较前几种方法非特异性染色轻。 四、ABC 法（Avidin-Biotin-Complex Method） Avidin——卵白素，有四个亚单位，每个亚单位有138个氨基酸，分子两68kD。 一个卵白素分子能与4个分子的生物素结合，基本上不可逆，比抗原抗体结合力 大1000000倍，只有在pH1.5的条件下才能将其分离。 Biotin——生物素，一分子的抗体可结合150个生物素分子，和多种酶结合后，不影响催化活性。 四、LAB法（ Labeled Avidin-Biotin） 特点：1.敏感性较PAP法提高20~40倍； 2.非特异性染色几乎没有； 3.可用于IHC，核酸杂交等 五、免疫组织化学染色方法的选择原则五个“S”原则 1.Specificity 特异性 间叶组织，上皮组织恶性肿瘤，多克隆抗角蛋白抗体 ，特异性广 鳞状上皮或腺上皮，单克隆抗角蛋白抗体， 特异性高； 2.Sensitivity 敏感性 敏感性高， 特异性下降，假阳性增加； 敏感性低，特异性高，假阴性增加； 3.Simplicity 简便性 选用方法愈简便愈好； 4.Safety 安全性 5.Save (time and money) 第二篇：免疫组织化学主要方法举例 步骤 取材： 主要来源于活检标本、手术切除标本及尸体解剖标本。前两者要求为新鲜组织固定后的，后者要求机体死亡24h以内。 固定： 可通过物理或化学的方法，使细胞内蛋白质凝固，终止外源性、内源性分解酶作用，防止细胞自溶，保持组织细胞原有的结构和形态，减少细胞内可溶性蛋白、脂肪、糖类等物质的丢失。即要保持组织结构、细胞形态的完整，又不损害组织细胞内的抗原性物质。病理科通常用的是10－20％福尔马林固定剂。冰冻切片固定剂，可采用4C冷丙酮固定。 切片： 切片厚度为3－5um，切片太厚会影响组织化学染色结果和判断，并易在染色过程中脱片。 为防止脱片我们可采用； （1） 用于免疫组织化学染色的载玻片须浸入清洁液内浸泡12－24h，取出蒸馏水洗数遍后，置于烤箱烤干。 （2） 载玻片还需涂粘附剂。常用粘附剂有树脂胶、防脱片剂、多聚赖氨酸。以后者最为常用。 抗原修复液： 抗原修复缓冲液种类很多如TBS、PBS、重金属溶液等，但长期实践证明以0,01mol，pH6.0的柠檬酸缓冲液是效果较好、最常用的一种缓冲液。 微波炉加热法： 微波炉选用700－800W带转盘温度显示的国产微波炉即可。 方法： 1、石蜡切片脱蜡至蒸馏水。 2、将切片置于微波炉专用塑料切片盒内。 3、在盒内放入200ml柠檬酸缓冲液，并盖上带有小孔的盖子。 4、将塑料盒置于微波炉中央，温度保持在92－100℃之间，持续2个3分钟。若第一次5分钟后液体蒸发减少，可加入蒸馏水，再进行第二次5分钟。期间组织不可干燥。 5、将塑料盒移至室温冷却。 6、蒸馏水洗2个3分钟。 7、阻断内源性过氧化物酶，切片入蒸馏水。 8、用TBS或PBS液洗2个3分钟。 9、组织化学染色。 高压加热法 ： 将切片连同缓冲液放入高压锅内，加热至产生蒸气，并持续2min。 单纯加热法： 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉上加热至沸腾，并持续10min。 热水浴法： 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中，置于水浴锅中并加热至92－98C之间（不沸）20－30min。 胰蛋白酶消化法： 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。将切片放入湿盒内37C温箱中消化20min。 胃蛋白酶消化法 ： 用0.1mol/LHCL配制成0.4％的胃蛋白酶，以37C消化20min即可。 链霉蛋白酶消化法 ： 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.