【2017年整理】In vitro pull down.docVIP

Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。Pull-Down实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。Pull-Down vs.免疫沉淀Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用诱饵蛋白代替了抗体。在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。诱饵蛋白固相化策略依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如‘bait the hook’）。如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的标签，以适用于现成的亲和树脂。即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。 如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体。接下来的试剂盒被优化用于这些特别的亲和系统。列于下面几页中的Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒，使用含有GST标签的特异GTPase蛋白的下游效应子进行检测。生物素标记Pull-Down链亲和素琼脂糖树脂链亲和素琼脂糖树脂GST Pull-Down实验 GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 三、多组氨酸Pull-Down实验 用于捕获及纯化与多组氨酸标签融合蛋白发生相互作用的蛋白。实验者需提供含有标签的融合蛋白（诱饵）及表达推测蛋白相互作用靶蛋白（猎物）的细胞活化的GTPase Pull-Down 每个小GTPase各自的下游效应器的结合结构域均以GST融合蛋白的形式表达，当其固相化于树脂之上，可用于pulldown（例如，亲和纯化）活化的或结合GTP的GTPase。例如，Raf1的GST-RBD（Ras结合结构域）可以pull down活化的Ras。通过Western Blot对被pull down的活化的GTPase进行检测。 使用各自的Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒检测活化的Ras，Cdc42，Rac1，Rho和Rap1。使用GTPγS或GDP处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST融合蛋白及固定化的谷胱甘肽孵育。一半洗脱下来的pulldown样品（25μl）和20μg裂解液通过Western blotting进行分析，分别使用抗-Rac1，抗-Cdc42，抗-Pan-Ras，抗-Rho或抗-Rap1抗体。GDP导致的失活证实了活化的GTPase检测的特异性。 ? Thermo Scientific活化的GTPase Pull-Down和检测试剂盒与供应商U试剂盒的性能比较。使用各自的试剂盒对GTPγS或GDP处理的NIH3T3细胞裂解液（500μg）进行Rac1，Cdc42，Ras，Rho和Rap1的亲和沉淀。一半洗脱的pull-down样品（25μl）用Western blot进行分析。根据厂商说明书的指导进行分析。 Thermo Scientific活化的Rac1 Pull-Down和检测试剂盒的灵敏度。不同量的GTPγS处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST-Pak1-PBD