肉制品中驢源性成分PCR方法的建立及其应用.docVIP

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及其应用 摘要：本研究建立了对驴源性成分快速分子检测方法，确立了一对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR，扩增目的片段的长度是294 bp，经验证引物对驴源性成分的特异性良好，确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认，所得181 bp和113bp片段与分析结果一致。利用本法对抽取的样品进行检测，检测结果准确。 关键词：驴源性成分；检测方法；PCR反应 中图分类号： S822 文献标识码：A Establishment and application of PCR method to the donkey derived ingredients in meat products 随着现在人们生活水平的提高，对肉的要求也越来越高，而目前国内市场上在肉和肉制品的生产与销售中，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者，谋取暴利的事件屡屡出现。我国食品工业飞速发展，食品的掺假方式越来越多、范围越来越广、内容越来越复杂。一些不法商家或个人为了追求自身利益而以低价劣质的肉冒充高价优质的肉[1]，如用鸡肉冒充猪肉，猪肉、鸭肉冒充牛羊肉等造假行为最为常见。这不仅仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响着消费者的健康。此外，例如在清真食品中掺杂进猪肉等还涉及到宗教信仰等问题。因此，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检验显得十分必要，其重点就是在快速、准确的鉴定肉制品品种。 保定驴肉火烧是著名小吃，和保定三宝并驾齐驱。驴肉中必需氨基酸含量非常丰富，并且富含人体所必需的脂肪酸，是一种高蛋白，低脂肪的营养食物，此外，驴肉中矿物元素铁含量高于其他畜禽肉，其食用价值高、营养丰富、味道鲜美，值得大力开发研究和推广[2]。也是由于上述原因，驴肉在人们日常生活中的需求量越来越大，价格越来越高。致使掺假问题也越来越普遍，因此肉种类的鉴定在食品分析方面是一个重要的问题。 PCR技术已经是食品中肉类成分鉴别的主流技术，研究的对象主要集中在市场上常见的羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉上，但是还没有关于驴源性成分PCR检测方法的报道。本研究合成了一对用于检测驴源性成分的特异性引物，通过对反应体系的摸索及反应条件的优化，验证了方法的特异性与灵敏度，建立了鉴定驴源性成分的PCR技术，为杜绝贸易中的欺骗行为提供了快捷可靠的检测方法。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、10×PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、2000 bp ladder DNA marker、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自北京天根生化科技有限公司；Sau3AⅠ、AluⅠ限制性内切酶购自宝生物工程有限公司。引物合成及序列测定均由由上海生工完成；其余试剂均为国产分析纯。 实验仪器：进口ABI梯度PCR扩增仪、凝胶成像仪及电泳系统、sigma台式离心机。 1.2 PCR引物 合成一对特异性引物，用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成100mol/L的储备液。引物序列：上游引物序列为：5’- TGCCACAGTTGGATACATCAAC-3’；下游引物序列为：5’- ATTGAGATTAGGCGATTGTT -3’，扩增的目的条带长294bp。 1.3 样本总DNA的提取 驴肉基因组DNA的提取根据购自天根公司的《血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒》说明书进行提取。提取完成后取适量基因组DNA在紫外分光光度计下检测其浓度和纯度。当OD260/280数值在1.7～1.9之间时，DNA的纯度才适宜进行PCR扩增。 1.4 目的条带的扩增 PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液（Mg2+ free）5 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4.0 μL，引物HorseF和HorseR（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板10.0 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL ）0.3 μL，补足无菌超纯水到25.0 μL。 PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s， 35个循环；最后72℃延伸5 min。结束后4℃保存。 PCR结束后用2.0%的琼脂糖凝胶， TAE电泳缓冲系统，9 V/cm恒压电泳，2000 bp ladder作为分子量对照对目的条带进行检测。 1.5 目的条带Sau3AⅠ、AluⅠ的酶切鉴定及测序 由于目的条带有可能是马源性成分，因此扩增产物需要用马源性成分的限制性内切酶Sau3AⅠ进行酶切，片段大小是226 bp和68 bp。驴源性成分的PCR扩增产物经限