优·第11章-植物生物学.pptVIP

解冻速度是解冻技术关键，一般在37℃的热水浴中解冻。 解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。 解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。 * 生长季节中的材料，一般在37～40 ℃温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。 木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0 ℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。 * 保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再生植株。 * （6） 超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术 无论哪种种质资源的保存方法都是以保持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温保存过程中，植物材料是否发生变异是育种工作者十分关心的问题。 * 为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段进行有效的检测体系。 形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记如RFLP和RAPD等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。 * （7）再培养 　　 经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，再转入正常光下培养。 * 再培养所用的培养基 一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。 * 一般为愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖 * 11.3.2 玻璃化冻存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 * 用玻璃化法冻存程序是： （1）使用冷冻保护剂溶液对材料进行预处理； （2）然后用玻璃化溶液进行脱水处理； （3）最后投入液氮保存。 1．玻璃化法 是将生物材料直接经极高浓度的玻璃化保护剂快速脱水后，直接投入液氮。使生物材料在快速降温时胞内胞外都进入玻璃化态, 而不形成冰晶, 从而避免了细胞结构的破坏。 此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。 * Sakai 1991 设计的玻璃化保护剂PVS2 30%甘油+15%乙二醇+15% DMSO +0.4mol/L 蔗糖+MS无激素培养基 * 2．包埋脱水化法 茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包埋后, 第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水, 第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水, 然后投入液氮贮存。 可以保护材料的结构不会遭到破坏。 * 优点： 不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程不甚严格；同时避免了玻璃化法中二甲亚砜等高浓度保护剂对材料可能造成的损害；样品易于操作，被保存样品体积可以比较大；样品可获得较高的抗冻力，提高保存效果，使保存后的样品不经愈伤组织直接成苗，降低了变异的可能。 * 3．包埋玻璃化法 是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保 存。 材料存活率比用包埋—脱水法要高，藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 * * 玻璃化冻存的材料在保存终止后，快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。 材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。 新疆紫草高产细胞系的超低温保存程序 （李国凤等，1992) 1. 将高产细胞系的愈伤组织放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（7.5% 的二甲基亚砜＋0.5mol/L 山梨醇＋5% 甘油＋5%蔗糖) 密封试管，继续在冰浴中停留15min左右 经过保护剂处理的愈伤组织，以1℃/min的速度冷却，从1℃降低到-40 ℃，在-40 ℃停留2h后投入液氮罐-196 ℃储存。 * 4. 当需要使用细胞系时，将保存的愈伤组织用40 ℃的温水浴快速化冻，并以消毒过的培养液彻底洗涤， 5. 接种到继代培养基上，在25℃下暗中培养，愈伤组织即可逐渐复苏，恢复生长。 实验证明，在-196 ℃的超低温条件下细胞系的生活力和高产特性可以长期保存下去。 * * 20 世纪70 年代以来, 植物资源超低温保存研究取得了很大的进展,