第三章重组DNA技术所需的基本条件.ppt

λ 噬菌体生物学特性： 生物结构 噬菌体或病毒DNA λ 噬菌体生物学特性： 感染周期 噬菌体或病毒DNA λ 噬菌体生物学特性： 感染周期 噬菌体或病毒DNA λ 噬菌体生物学特性：溶原状态 λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体 DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为 溶原状态 。 整合主要由 λ-DNA上的 cI和 int两 基 因 的 产 物 所 激 活 ， 而 这 两 个 基 因 的 开 放 与 关 闭 又 取 决 于宿主细胞本身的性质。 人们可以根据需要改变 λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：缩短长度 野生型 λ-DNA包装的上限为 51kb，本身长度为 48.5kb，只有当 插 入 的 外 源 DNA片 段 不 大 于 2.5kb时 ， 才 能 被 包 装 成 有 感 染力的噬菌体颗粒。 因此缩短野生型 λ-DNA的长度，可以提高装载 量 。 其 实 野 生 型 λ-DNA上 约 有 40-50%的 片 段 是 复 制 和 裂 解所非必需的。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点 野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和 7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶切位点 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：加装选择标记 与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此 加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容 λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记 基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶 原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭 活， λ-重组分子便进入溶菌循环，形成 透明斑。 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，能催化 无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基 因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。 噬菌体或病毒DNA λ-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（sup) 是指由 CAG（Gln）向 UAG（stop）的突变。 大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正 tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型 λ-DNA上 D和 E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码子 突 变 成 UAG。 当 这 种 λ-DNA进 入 一 般 的 大 肠 杆 菌 菌 株 后 ， 不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 核酸酶 单链核酸外切酶：核酸外切酶 VII（ ExoVII） 2+ 核酸酶 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII） 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3‘ 端外切 核酸酶 双链核酸外切酶：λ 核酸外切酶（ λExo） λ核酸外切酶特异性地从5‘ 端外切 Zn2+必需 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 2+ 最适 pH范围为4.0 - 4.3 需要 NaCl 10 - 300 mM 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快 7倍 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本反应： 内切单链DNA或RNA 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本反应： 内切带缺口或缺刻的双链DNA或 RNA 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的重要用途： 在 DNA上定位 RNA（ S1 mapping） 核酸修