第一章蛋白质203.pptVIP

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目（N-末 端和C-末端氨基酸残基的鉴定） （2）拆开蛋白质分子的多肽链（二硫桥的断裂） （3）氨基酸组成的分析 （4）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 （5）肽段氨基酸序列的测定 （6）肽段在多肽链中次序的决定 （7）二硫键位置的确定 2.测定蛋白质一级结构一般步骤  目前研究蛋白质的三维结构所取得的成就主要是应用间接的X射线衍射法（X-ray diffraction method）取得的。X射线衍射技术的原理是将X射线（λ=0.154nm）投射到被检物体上，经物体散射后的衍射波含有物体构造的全部信息，用数学方法处理衍射图案，绘出电子密度图，从中构建出三维分子图象——分子结构模型（55页 图3-16） （一）研究构象的方法 （二）蛋白质的构象 在一级结构基础上，蛋白质分子的多肽链按一定方向折叠、盘绕或组装成特有的空间结构，亦称高级结构，蛋白质的高级结构即蛋白质的构象问题。 1.构型和构象 （1）构型（Configuration） 是指一个分子中某不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排列。任何一个不对称碳原子相连的四个不同原子或基团，只可能有两种不同的空间排布，即两种构型：D-构型和L-构型。构型的改变涉及共价键的断裂和重组。  是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的改变不需要共价键的断裂和重新形成，只需单键旋转方向或角度改变而即可。 （2）构象（Conformation） 构型 构象 Linus Pauling和Robert Corey利用X-射线衍射技术研究蛋白质肽键结构时发现，肽键上的四个原子和相邻的两个Cα都处在一个平面上。被取代的氨基上的氢几乎总是与羰基的氧处于相反的位置。肽单位中羰基碳原子与氮原子之间所成的键长度为1.32?，介于单键C-N（1.49?）和双键C-N（1.27?）之间，所以具有部分双键的性质，不能自由旋转，其中绝大多数都形成的酰胺平面结构（肽平面） 2.蛋白质的构象 而α-碳原子与羰基碳原子之间的键是一个纯粹的单键，α-碳原子与氮原子之间的键也是一个纯粹的单键。因此，刚性的肽单位是由Cα原子隔开的多个平面组成的。由于主链上有三分之一不能自由转动的键，又因为Cα-N和Cα-C键旋转时将受到α-碳原子上的侧链R基的空间阻碍影响，所以使肽链的构象受到限制，只能形成一定的构象。如果每一个氨基酸残基的φ角（绕Cα-N键轴旋转的二面角）和ψ角（绕Cα-C键轴旋转的二面角）已知，多肽主链的构象就被完全确定。如当Cα的一对二面角φ=180o和ψ=180o时，Cα的两个相邻肽平面将呈现充分伸展的肽链结构 蛋白质分子之所以能维持其稳定的构象，主要是由于蛋白质分子中存在着许多带电荷基团和极性、非极性基团，这些基团之间相互作用形成各种次级键，这些次级键的键能都较弱，但由于它们在蛋白质分子中广泛存在，所以对维持蛋白质分子的空间结构起到了决定的作用。维持蛋白质构象的作用力主要有以下四种类型： 1.氢键 2.离子键 3.疏水作用力 4.范德华力 此外，还有 二硫键 配位键 酯 键 蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链主链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。天然蛋白质一般都含有α-螺旋、β-折叠片、β-转角和自由卷曲等二级结构。 三 蛋白质的二级结构 1.?-氨基参与的反应 又如酰化试剂如丹磺酰氯被用于多肽链N末端aa的标记和微量aa的定量 测定。在碱性条件下，丹磺酰氯（5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯）可以与 N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺 酰氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10- 9mol （2）酰化反应 氨基酸的化学性质 用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等 1.?-氨基参与的反应 （3）烃基化反应（Sanger反应） 氨基酸的化学性质 用途：鉴定多肽或蛋白质N-端氨基酸的重要方法。 在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基很容易与2，4-二硝基氟苯（缩写为FDNB或DNFB）作用，生成2，4-二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）。 多肽或蛋白质的N-末端氨基酸的α-氨基也能与DNFB反应，生成DNP-多肽。由于硝基苯与氨基结合牢固，不易被水解，因此当DNP-多肽被水解时，所有肽键均被水解，只有N-末端氨基酸仍在DNP上，形成黄色的DNP-氨基酸，将其与其它氨基酸分离开来，再利用层析法鉴定此氨基酸的种类，就可用于测定多肽链的N-末端氨基酸。 桑格（Sanger）反应： 1. ?-氨基参与的反应 （3）烃基化反应（