【2017年整理】蛋白质浓度的测定.docVIP

?实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法 ? 目的要求 ? 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 ? 实验原理 ? 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 ? ? 试剂与器材 ? 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。 ? 二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。 2．未知蛋白质溶液。 ? 三、器材 试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。 ? ? 操作方法 ? 一、标准法制定标准曲线 取14支试管，分两组按下表a平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表a 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.15mol/L NaCl/ml 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考马斯亮蓝试剂/ml 5ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 A595nm　 　 　 　 　 ? 　 　 ? 二、微量法制定标准曲线 取12支试管，分两组按下表b平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表b 试管编号 0 1 2 3 4 5 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.15mol/L NaCl/ml 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 考马斯亮蓝试剂/ml 5ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 A595nm　 　 　 　 　 　 　 ? 三、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。 ? ? 注意事项 ? （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 ? ? 思考题： 根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度： （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） 要求在半天内测定60个样品。 （3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。 实验三、考马斯亮蓝染色法