第六章 负染色技术newC--精.pptVIP

第六章  负染色技术 第六章 负染色技术 一、基本概念 1.正染色: (positive staining) 阳性反差，利用高密度的重金属染色剂（铅、 铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加 样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差 的方法。 特征：明场,背景亮,材料深暗 2.负染色: (Negative Staining) 阴性反差染色，某些高电子密度的物质去包围 低电子密度的样品,在黑暗的背景上,反衬出明 亮的样品形貌。 特征：暗场,背景深暗,材料亮 1、密度反差原理： 2、异常反差原理： 五、负染色样品的制备 颗粒状悬浮样品 1、植物病毒 浸出法（浓度105个/ml） 针刺法 2、细胞培养物 3、动物组织培养物 浓缩以增加病毒的检出率 六、负染色剂 1、对染色剂的要求： ⑴、高电子密度，电子散射能力强 ⑵、熔点高，电子照射不升华 ⑶、溶解度大，不析出沉淀 ⑷、本身无结构，与样品不发生化 学反应 ⑸、分子小，易于渗透到不规则表 面的凹陷处。 2、常用的染色剂 ⑴ 磷钨酸类 KPT，NaPT，PTA 优点： 适于大多数样品,,颗粒细腻,反差 好,图像 背景干净、杂质少 常用1～5％溶液，pH＝6.8～7.4 缺点： 显示样品的结构细节较差，对某些 病毒易产生破坏作用。 ⑵ 醋酸铀（醋酸双氧铀） UO2(CH2COO)22H2O pH＝4.0～5.2，0.5～4％水溶液 优点： 显示病毒细节好，反差强，对 样品破坏小 缺点： 颗粒性杂质多，当pH6.0产生 沉淀而失效，见光分解 ⑶甲酸铀： 0.5～1%水溶液，pH=4.0-5.2,不稳定， 现配现用 ⑷钼酸铵： 1～3％水溶液或醋酸铵溶液，pH=4.0～ 9.0 反差小，性能稳定，适于有界膜的 生物样品 ⑸硅钨酸： 1～2％，中性偏碱下使用 1.滴染法: (悬滴法) 低浓度的病毒样品可获得较好效果 滴样→滴染液→漂洗 2. 喷雾法 优点：样品在膜上分布均匀，雾滴小 缺点：操作繁琐，样品用量大，混合时易产生沉淀。 3. 漂浮法： ① 沾样 ② 吸取多余液体 ③ 滴染液 　　理想的负染色样品图象： 　　均匀,没有边缘效应,反差良好,柔和 １、样品纯度：适当提纯，杂质不宜太 多，特别不应有过多的糖类 ２、样品浓度适宜： 　　高浓度：样品堆积、重叠 　　低浓度：寻找困难 ３、样品分布均匀 　　A、使用分散剂： 　　B、亲水处理： 4、样品悬液和染液pH的问题 pH＝6.7～7.2 5、染色的时机 不干不湿，存放时间不宜太长 6、用双蒸水充分漂洗 7、观察时用小孔径的光阑，提高反差 生物电子显微技术 样品 染料 铜网 负染色原理图 1. 优点： ⑴ 提高了样品的分辨率和反差高。 分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径 约D=7?时，?＝10～15?，最高?＝5～7?。 ⑵ 常用、简易、快速、不要求高纯度的样品 制备技术，且用量少 ⑶ 不改变生物活性，即不因染色造成样品变 形。 二、负染色的特点 2. 缺点： ⑴ 负染原理不清楚，结果不稳定，规律 性、重复性差。 (操作时，因样品的种类、染色液浓 度、pH值变化常难以掌握。) ⑵ 负染色技术只能观察样品表面形貌， 内部结构看不清楚。 三、应用 1、按研究样品分: 观察和研究细菌、原生动物、生物大 分子、亚细胞碎片、分离的细胞器、 蛋白质晶体、病毒病原物 2、按研究方向分: 免疫学、细胞化学 PTA染液 样品氧化镁 四、负染原理： 七、负染色方法： 八、影响负染效果的因素 番茄黑环病毒 病毒荚膜：未处理 * *