酶工程實验报告四.docVIP

本科学生实验报告 学号： 124120463 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术班 实验课程名称： 酶工程实验 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印 云南师范大学教务处编印 实验序号及名称：实验四、淀粉酶粗酶液最适反应pH的测定 实验时间： 2015.5.16 实验地： 睿智三121实验室 实验目的： 了解不同pH对酶活性的影响，掌握酶最适反应pH的测定方法。 实验原理： 当酶分子处于最适pH反应介质中时，酶、底物和辅酶的解离情况，最适宜于它们结合，并发生催化作用，使酶促反应达到最大值。当反应介质的pH偏离酶的最适pH，可影响酶分子，特别是活性中心上必须基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当pH发生较大偏离时甚至会引起酶的变性。每一种酶都有其适宜pH，在酶催化反应过程中，必须控制好pH。 实验材料 （一）实验试剂 1.淀粉酶发酵粗酶液 2.不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液 3.2%（w/v）可溶性淀粉溶液（现配现用） 称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸 直到淀粉完全溶解； 冷却，调不同的pH值，并用缓冲液定容至100mL。 5. DNS试剂 （二）实验仪器 1.试管及试管架 2.10mL离心管 3.离心机 4.移液器 5.电子天平 6.恒温水浴锅 7.pH计 8.涡旋混合器 9.紫外可见分光光度计、比色皿、记时器 10.电磁炉、搪瓷缸 四 实验方法、步骤及注意事项： 1.本实验选择不同pH测定淀粉酶粗酶液酶活力，以找出酶在此条件下的最适pH 。反应温度为上次实验测出的最适反应温度。 2.用不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释酶液至合适倍数。 3.取18支试管，分别按下表编号并放入相应温度的水浴中 试管号 对照 1支 反应 2支 对照 1支 反应 2支 对照 1支 反应 2支 对照 1支 反应 2支 对照 1支 反应 2支 对照 1支 反应 2支 反应 pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 4.按淀粉酶酶活测定方法测定在不同温度条件下淀粉酶发酵粗酶液的酶活力。 5.计算结果 6.结果处理：列出不同pH下酶活力的实验测定数据，并绘出pH曲线，找出最适pH 。 注意事项 1、每个同学都参与实验 2、称量天平分开使用 3、称量器皿用后摖净后再使用，避免叉污染试剂。 使用前检查仪器设备是否完好，使用后及时清理干净。 五 实验结果分析： （一）实验结果 测得实验数据如下表 PH A管O 值 B管O 值 平均值 4 1.011 0.949 0.98 5 1.556 1.530 1.543 6 1.749 1.666 1.7075 7 1.638 1.556 1.597 8 0.683 0.665 0.674 9 1.001 1.011 1.006 计算酶活所用的标准曲线如下图： PH=4时 和根据测量的数据和根据酶活计算公式： 酶活（U/ml）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5 A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数 5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积 T:反应时间（min） 1000:转换因子1mmol=1000μmol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol） 计算出酶活列表如下（稀释了 8倍）： 酶活（U/ml）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5 =((0.98×0.9479+0.126)×8×1000/(10×180.2)) ×5 =23.417 U/ml PH=5时 酶活（U/ml）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5 =((1.543×0.9479+0.126)×8×1000/(10×180.2)) ×5 =35.263U/ml PH=6时 酶活（U/ml