rBTI的内化及诱导Hep G2细胞自噬的研究[精].docVIP

rBTI的内化及诱导Hep G2细胞自噬的研究 【摘要】：蛋白酶抑制剂广泛分布于自然界中,以不同形式存在于植物,动物及微生物体内,是一类可以作用于蛋白酶,并对酶有特异性抑制作用的小分子物质或蛋白质。它们按一定比例与酶结合形成可逆的蛋白质复合物,在血液凝固,补体级联反应,细胞凋亡的调控以及激素加工处理等过程中发挥重要的作用。荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是由69个氨基酸组成的分子量为7.9kD的耐热小分子蛋白,属于PotatoI型蛋白酶抑制剂家族。本课题组的前期研究表明,重组的荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinantBuckwheatTrypsinInhibitor,rBTI),对HepG2,EC9706,K562,HL60等肿瘤细胞株都有明显的抑制生长并诱导其凋亡的作用,而对正常肝细胞HL7702没有影响；rBTI可以诱导促凋亡基因表达上调,抗凋亡基因表达下降,可以使EC9706细胞周期阻滞于Go/G1期,但是具体的分子机制还不清楚。本研究选用pExSecI表达载体,构建了含有BTI基因的表达质粒pExSecI-BTI,经原核表达和纯化,获得了无融合标签的rBTI,分析了rBTI内化进入HepG2细胞的机制,探讨了其诱导HepG2细胞自噬的分子机制,以及与细胞表面的可能受体uPA的相互作用。主要结果如下：1.构建了原核表达载体pExSec-BTI,并对其表达条件进行了优化,当诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L,诱导时间为3.5h时,rBTI的表达量最高。根据rBTI执稳定性好的特点,对rBTI的纯化条件进行了优化(80热处理20min),经ResourceTMQ离子交换层析一步纯化即可获得纯度大于95%的rBTI。这一纯化步骤应用于rBTI的大规模制备亦十分有效。2.将rBTI用FITC标记,综合运用多种内吞抑制剂及方法,如NH4CI,MDC,K+,蔗糖溶液等,以及RNA干扰,M期阻滞等技术和激光共聚焦显微镜研究了rBTI进入HepG2细胞的方式。提出rBTI以细胞膜上尿激酶型纤溶酶原激活子(uPA)为受体,通过网格蛋白依赖性的内吞作用进入细胞,呈现浓度和能量依赖性,其中细胞膜电位在内吞过程中起着重要作用。3.采用透射电子显微镜,MDC染色,流式细胞术等技术研究了rBTI诱导的HepG2细胞自噬。rBTI作用HepG2细胞后,透射电子显微镜观察到细胞内部出现自噬体以及自噬溶酶体结构,细胞发生了自噬,细胞的自噬活性与rBTI的浓度呈正相关。通过MDC染色以及pCMV-GFP-LC3转染实验,进一步确定了rBTI可以诱导细胞产生自噬,当rBTI诱导4h后,HepG2细胞即发生明显的自噬现象。应用激光共聚焦显微镜观察了rBTI作用前后胞内细胞器的变化。在rBTI作用12h后,HepG2细胞内质网和溶酶体发生较大的变化,线粒体膜的通透性发生改变,但是细胞核的变化不明显。通过自噬抑制剂3-MA的联合使用以及细胞恢复实验等方法,明确了rBTI诱导的细胞死亡主要是自噬性程序性细胞死亡。4.构建了pEGFP-N1-BTI单色荧光载体及pDsRed1-N1-EGFP-BTI双色荧光载体,观察了rBTI在HepG2细胞内的定位,确定了rBTI主要定位于胞质中的自噬体及自噬溶酶体。据此我们提出假说：作为外源物的rBTI被细胞内的自噬相关分子选择性识别,进入自噬溶酶体被降解,过度的自噬诱发细胞失去固有的稳态,进而走向死亡。即rBTI介导的细胞死亡是一种底物特异性的死亡机制。通过RT-PCR的方法,对rBTI作用后三个自噬相关分子(mTOR,Beclinl和PI3K)进行了RNA水平的分析,结合3-MA抑制剂实验,初步确定rBTI诱导的细胞自噬主要受Beclin1复合物的调控。5.通过荧光光谱法、凝胶电泳法等,进一步确定了rBTI与uPA之间存在相互作用。在体外条件下,rBTI可作为uPA的底物,被uPA水解为两个片段。采用RT-PCR的方法,对rBTI作用后,uPA以及uPA下游两个分子(MMP-2和MMP-9)进行了检测,并通过明胶酶谱和细胞划痕实验研究了rBTI对HepG2细胞迁移的影响。结果表明,rBTI可以诱导uPA,MMP-2和MMP-9的表达,并促进HepG2细胞迁移。【关键词】：荞麦胰蛋白酶抑制剂Potato型抑制剂细胞自噬尿激酶型纤溶酶原激活子抗肿瘤 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2012 【分类号】：Q25 【目录】：中文摘要14-16ABSTRACT16-19第一章文献综述19-481蛋白酶抑制剂概述19-241.1蛋白酶抑制剂的分类及特征19-221.1.1Bowman-Birk型抑制剂(BBI)19-201.1.2Kunitz型抑制剂