食品生物技術导论.docVIP

食品生物技术的基本概念：食品生物技术是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料的技术。 食品生物技术的研究内容：基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、生物技术下游技术、现代分子检测技术。 食品生物技术核心和基础：基因工程技术。 食品生物技术作用:设计新型的食品及其食品原料为发酵工业提供品质优良的工程菌种，促进发酵工业发展开发新型的对人类有益的蛋白质和酶促进功能因子的提取技术的发展改变传统的食品加工工艺，提升食品的品质食品分析和保鲜处理食品工业废水。 基因工程的操作步骤：在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒、噬菌体）把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体把重组体引入宿主细胞筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。 食品DNA提取的方法：CTAB法和SDS法。 基因工程的工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酯酶、S1核酸酶、逆转录酶。 Ⅱ型限制性内切酶：一类分子质量较小的单体蛋白，作用时仅需要镁离子存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段；切割特点是：一般能识别和切割 4~8个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构；没有甲基化修饰酶功能；切割方式切割产生5突出的粘性末端 切割产生3突出的粘性末端切割产生平头末端。 内切酶 识别位点 末端类型 内切酶 识别位点 末端类型 Bbu Ⅰ CGACG 3突出 NotⅠ GCGGCCGC 5突出 CGTACG CGCCGGCG Sfi Ⅰ GGCCNNNNNGGCC 3突出 Sau3AI GATC 5突出 CCGGNNNNNCCGG CTAG Eco RⅠ GAATTC 5突出 AluⅠ AGCT 平头末端 CTTAAG TCGA Hin dⅢ AAGCTT 5突出 HpaⅠ GTTAAC 平头末端 TTCGAA CAATTG 限制性内切酶的反应系统：底物DNA、反应缓冲液、酶、 反应温度、时间。大多数最适温度37℃，只有TaqI是65℃、SmaI是25℃。同裂酶：来源不同，具有相同的识别序列。同尾酶：识别序列不同，末端相同。 Ⅱ型限制性内切酶的主要用途：在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱构建基因文库用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。 DNA连接酶种类：来源于大肠杆菌染色体编码的连接酶来源于大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶。最常用的：来源于大肠杆菌染色体编码的连接酶。 DNA聚合酶种类：DNA聚合酶Ⅰ（基因工程最常用）、Ⅱ（式量12万肽链）、Ⅲ（式量25万蛋白质）。 基因工程载体：承载目的基因或外源DNA片段进入宿主细胞，并且使其得以维持的DNA分子。 基因工程载体特征：能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性易于从宿主细胞中分离，并进行纯化在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点。这些位点位于DNA复制的非必需区，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制具有能够直接观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以为重组DNA选择的标志。 质粒载体：是能自主复制的双链DNA分子，能在细菌中独立于染色体之外而存在。 目的基因的制备方法：目的基因的直接分离法、基因文库筛选法、聚合酶链式反应法（PCR）、基因的化学合成法。 目的基因的直接分离法：（1）限制性内切酶酶切法（2）物理化学法密度梯度离心法单链酶法分子杂交法（3）逆转录获取法。 基因文库筛选法：鸟枪法、基因组文库法、cDNA文库法。 PCR(聚合酶链式反应）定义：是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。 PCR步骤：变性。将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA。退火。将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对。延伸。将反应体系温度升高到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环，即可扩增得到目的DNA序列。 PCR反应体系：要有与被分离目的基因的DNA双链两端序列相互补的DNA引物（约20个碱基）