《分子医学技能》实验3yan 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定.pptVIP

2 BamHI 、HindⅢ酶切重组质粒及鉴定 1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） * 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III 2 实验材料: 重组质粒; BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。 * 3 实验步骤: A 建立反应体系 B 酶切反应（温育1-3h） C 电泳鉴定 * 4、双酶切体系（0.2mlEP管）： 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl * 合计 20μl 酶切混合液10 μl 同学自己加 37 ℃，12h **剩余质粒交给老师，连同酶切产物下次电泳鉴定 思考题？ 质粒DNA制备与基因组DNA制备有哪些异同？ 质粒DNA的鉴定有哪些方法？ 基因载体应该具备哪些特点？ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？ * 左下角处有超级链接到配伍末端 1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒 实验三 实验目的 掌握质粒提纯的原理和方法; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶. 预习：基因克隆示意图 基因克隆操作过程： 分 分离载体和目的基因 切 限制酶切载体与目的基因 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 基因载体（gene vector） ＊什么是基因载体 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 ＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件 基因载体应具备特点 1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增 2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力） 3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量） * 基因载体类型 质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC） * 一.质粒DNA的制备 1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？ * (1)质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。 * ① 超螺旋DNA(SC DNA) (2)质粒的三种构型 * ② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。 * ③ 线状DNA(linear DNA,L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） * (3)质粒DNA的一般特性： ①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 * (4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程 2 提取质粒DNA的常规方法: 2.1 核酸分离纯化的总原则： ? 保证核酸一级结构完整 ? 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、