《分子医学技能》03琼脂糖电泳HBV PCR-银染SSCP PCR.pptVIP

实验三琼脂糖电泳检测HVB PCR结果银染技术检测HLA基因多态性 HBV-PCR产物 实验评价与总结 制备聚丙烯酰胺凝胶 PCR产物电泳 HLA基因PCR产物 制备琼脂糖凝胶 PCR产物电泳 硝酸银染色 电泳 染色 制胶 观察结果 本次实验课时间安排 30-40 min 1-1.5 h 15-20 min 30 min 讲解实验原理 1 h 非变性PAGE胶的准备 电泳槽的准备：将玻璃板装入密封胶条内，用2%琼脂糖（TBE溶液配制）封住玻璃板下沿空隙，等琼脂糖凝结后将玻璃板连同密封胶条装入电泳槽中，固定好，倒入电泳缓冲液。（此步由准备室老师完成） 制胶与灌胶：8%非变性PAGE胶，30ml配制总量 30%丙烯酰胺混合液 ddH2O 5×TBE 10%AP TEMED 8ml 15.7ml 6ml 280μl 20μl ？ml ？ml ？ml 280μl 20μl HBV-PCR电泳胶上样要求： 1 2 3 4 5 6 7 8 1. （空 ） 2. 正对照 3. 负对照 4. Marker（5ul） 5. 样品1 6. 样品2 7. 样品3 8. （空） 共4块胶 PCR反应结果 PCR-SSCP检测人HLA-DR基因多态性 实验操作及注意事项 主要技术和原理 技术： PCR 聚丙烯凝胶电泳 硝酸银染色 原理 多态性检测分子——HLA PCR－SSCP 硝酸银染色 基本过程 来源不同的待测样本 PCR扩增目的基因 变性成单链 PAGE电泳结果比较（银染） 实验目的及预期结果 目的： 检测来自不同样本的基因多样性 检测技术：HLA-DR基因的PCR-SSCP 预期结果： PAGE电泳条带的差异 人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）—— 人类组织相容性抗原 主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。 1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2 1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。 MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。 人HLA基因的结构 Class II Class III Class I DP DQ DR C4B C4A B1 C2 HSP TNF B C A E F G RING DP DM LMP2 LMP7 DQ DR B2 A2 B1 A1 A B TAP1 TAP2 B2 A2 B3 B1 A1 B* A Class II Class III Class I 第六对 染色体 HLA复合体位于第六对染色体的短臂上（6p21.3) HLA-DRB 基 因 单 倍 体 多 态 性 HLA－DR8 DRB1* 08 DRA DRB 9 HLA－DR1 DRB1* 01，10 DRA DRB 9 DRB 6 HLA－DR51 DRB1* 15，16 DRA DRB 9 DRB 6 DRB 5 HLA－DR52 DRB1* 03，11－14 DRA DRB 9 DRB 2 DRB 3 HLA－DR53 DRB1* 04，07，09 DRA DRB 7 DRB 4 DRB 9 DRB 8 HLA-DR 基因家族包括一个DRA 和 2-5 个DRB 基因座，不同 DRB 基因座在同一染色体上的组合形成HLA-DR单倍型。 DRB1、 DRB3、DRB4 和 DRB5 是功能基因，DRB9 是一个基因片段，DRB2，DRB6，DRB7，DRB8 为假基因（pseudogene）。 HLA单倍型 单倍型：Haplotype，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合 可以作为不同个体的遗传特征：多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换 按中国人常见的A座位基因有13