原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
* * 实验五 感受态的制备、 质粒的转化和筛选 2015-10-30 实验安排 感受态的制备 质粒的转化 第二天，观察结果 质粒酶切--电泳检测 上次实验产物（质粒） 酶切电泳点样安排 电泳上样： 1、所有同学各自的酶切产物（10-20 μl） 2、每排点样孔需有两种质粒：pUC119、pUC119-U6 3、同一人的“酶切前”与“酶切后”相邻点样 实验步骤 加1.5ml培养物于EP管，4000rpm×10min 加入冰冷CaCl2溶液300 μl，重悬菌体 沉淀中加入冰冷CaCl2溶液120 μl，重悬菌体 感受态制备 冰浴15-30min， 4000rpm×10min 收集沉淀，去上清 收集沉淀，去上清（去掉培养基） 实验步骤 每管感受态中加质粒5 μl，混匀 42 ℃ ，热激90秒，勿摇动 每管加LB 500 μl，37℃摇床，复苏30-40min 铺200 μl 菌液到LB琼脂平板，涂匀 转化 冰上静置20-30min 如何设计实验的参照体系（对照组）？ 筛选 实验步骤 LB培养基（X-gal, IPTG, Amp） LB培养基 感受态+质粒（ pUC119-U6 or pUC119） 感受态（无质粒） pUC119-U6 pUC119 对照组B ？ ？ ？ 对照组A ？ 基因克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 基因克隆示意图 基因克隆操作过程： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 重组DNA导入受体菌 LB 0.18M 0.1M CaCl2 0.1M CaCl2 H2O 细胞膨胀：低渗环境 胞膜收缩：低温环境 离子扩散： DNA-Ca2＋ 热休克： 42 ℃ 1L LB培养基: 10g 胰蛋白胨 5g 酵母提取物 10g NaCl 重组体的筛选 重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。 * *
文档评论（0）