聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶__培训课件.pptVIP

化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在30—60min内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。 pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。 4、凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。 凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。 5、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。 蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 电荷因素 分子大小 分子形状 6. 聚丙烯酰胺凝胶电泳类型 （1）按电泳槽形式不同分 管状 垂直板型 ( 蛋白质、核酸分离 ) 水平板型 ( 核酸分离 ) 几种常见的电泳槽 (2) 按制胶方式不同分 连续系统 只有一层 分离胶， 浓度均一。 不连续系统 制二层胶 分离胶 高浓度，浓度 均一。浓缩胶 低浓度 (3) 按分离原理不同分： * 常规PAGE也称天然状态生物分子PAGE ， 即在电泳过程中，生物分子如蛋白质仍保持天然构象、亚基之间的相互作用及生物学活性。是根据被分离组分的电荷、大小和形状三种因数综合效果进行分离。用于蛋白质、核酸一般分离分析。 * SDS根据被分离物的分子量大小差异进行分离，多用于测定蛋白质分子量。 * IEF根据被分离物的等电点差异进行分离，亦称等电聚焦电泳，如等电点不同的蛋白质，在一个pH值连续变化的PAG中电泳后，分别聚集在其等电点的pH处形成区带，因而得以分离。多用于测定蛋白质等电点。 * 浓度梯度分离胶为浓度梯度胶，即胶浓度呈均匀增加，根据分子大小进行分离。多用于测定蛋白质分子量。 （二）. PAGE分离乳酸脱氢酶(LDH)同工酶原理 1、同工酶概念 催化相同化学反应，但其酶蛋白的结构、组成略有不同，表现出理化性质和动力学性质不同的一组酶。 2、LDH同工酶催化的反应