磁粒法核酸提取的特点.ppt

* * * 磁珠式核酸提取体系 核酸提取的总体要求 高质量：纯度高并且尽可能不破坏核酸 高产量：样本量一定时尽可能提取多的核酸 高通量：同时提取多个标本 自动化：降低劳动量；生物科技的飞速发展，需要处理的核酸样本迅速增多，自动化提取核酸成为一种迫切需要的选择。 磁粒法核酸提取的特点 步骤： 裂解→核酸结合→洗涤→洗脱 特点： 提取时间短 不使用酚、氯仿 用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现高通量提取 目前处于市场发育阶段，是未来发展的方向 主要产品为国外产品：Promega、Roche、KingFisher、Dynal等，大多需要与专用仪器配套 提取方式 时间 自动化 酚、氯仿 经典方法 长 难 有 玻璃粉法 短 难 没有 离心柱法 短 难 没有 磁粒法 短 容易 没有 各种提取方式操作比较 磁粒法核酸提取基本步骤 裂解细胞或病毒颗粒 核酸与磁粒结合 磁分离弃上清 洗涤缓冲液洗涤磁粒 磁分离弃上清 洗脱液将核酸从磁粒洗脱 磁分离弃磁粒，收集上清 结 合 洗涤 洗脱 磁粒法提取核酸示意图 磁粒提取试剂操作方式 磁架 磁笔 自动提取仪 裂解 结合 磁分离 吸去废液 洗涤 洗脱 磁架提取核酸示意图 裂解 结合 转移磁粒 洗涤 洗脱 转移磁粒 磁笔提取核酸示意图 自动仪器提取 自动提取的原理与磁笔提取相同，只是用机器的运转代替手工操作，实现高通量提取和减少工作量。 磁珠提取方法的优化 裂解：裂解液配方，作用时间和温度等 结合：结合液的选择和用量等 洗涤：洗涤液配方等 洗脱：洗脱时间和温度等 主要实验结果 与其他方法或类似商业化试剂盒的比较 核酸提取的灵敏度： HCV RNA，HIV RNA，HBV DNA 与Qiagen 磁珠式核酸提取试剂盒的比较 HCV RNA提取比较 Ct值 方法 HCV样本1 HCV样本2 HCV样本3 Promega体系平行1 27.60 30.21 27.39 Promega体系平行2 27.72 30.84 27.20 Qiagen kit平行1 27.86 39.00 28.82 Qiagen kit平行2 27.33 33.58 28.55 HBV DNA提取比较 方法 HBV样本1 HBV样本2 Promega体系平行1 26.65 32.78 Promega体系平行2 26.84 32.52 Qiagen kit平行1 26.70 32.96 Qiagen kit平行2 26.71 32.28 提取灵敏度实验 阳性样本梯度稀释 国家灵敏度参考品 HCV RNA提取 HCV阳性样本10倍稀释梯度：100,10-1,10-2,10-3,10-4 磁珠提取与柱提取法比较（数据见下页） 稀释组 柱提取 磁珠提取 10-0 24.13 24.34 25.28 10-1 27.15 29.20 28.57 10-2 31.23 33.34 32.64 10-3 35.34 35.87 35.39 10-4 38.16 38.07 38.69 磁珠提取方法与柱提取法及水溶液梯度稀释样本比较 磁珠提取与柱提法的提取效果相当。在低浓度样本提取方面，荧光增量与稀释组无显著差异，此方法在去除样本中抑制物方面效果良好。 HCV RNA国家标准品检测 10份阳性参考品: P1~P10 HCV阳性参考品 Ct HCV阳性参考品 Ct P1 34.58 P6 ND P2 ND P7 36.18 P3 36.96 P8 ND P4 34.81 P9 32.16 P5 35.44 P10 36.73 HIV RNA提取 HIV阳性样本梯度稀释成1/5，1/25，1/50，1/100和1/200 五个浓度，提取RNA，原样本提取后用TE按相同比例稀释 ，上机比较。 稀释组 磁珠提取 1 - 28.88 1/5 32.09 31.29 1/5 35.78 33.93 1/50 37.17 35.59 1/100 38.83 36.12 1/200 - 37.33 HIV 样本稀释梯度： 1/5，1/25，1/50，1/100和1/200 HIV核酸国家参考品检测 HIV RNA灵敏度和定量参考品：B2－B5（至少检出B2-B3） HIV RNA线性参考品：A2－A5。 HIV RNA荧光定量标准曲线, 线形相关系数:0.9907 HIV 阳性参考品:P1, P2, P3, P5, P7, P8 HIV阳性参考品 Ct HIV阳性参考品 Ct P1 32.94 P5 26.42 P2 35.98 P7 28.93 P3 37.61 P8 32.55 HIV阳性参考品检测 中检所HBV核酸定量标准品检测 灵敏度参考品 L0 L