Aβ25-35誘导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立作者白燕.doc

Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡及AD细胞模型建立 白燕1，2，屈秋民（通讯作者），石婕 （1西安交通大学医学院，西安 710061；2西安医学院护理系，西安710021） 【摘要】 目的　探讨Aβ25-35对PC-12细胞凋亡的影响及建立阿尔茨海默病细胞模型的适宜条件。方法　以不同浓度Aβ25-35诱导PC-12细胞，并于多时间点观察细胞形态改变、应用MTT测定细胞活力以及检测细胞凋亡情况。结果　PC-12细胞在不同浓度Aβ25-35诱导下细胞活力均有不同程度下降（P≤0.05）。结论　Aβ25-35可诱导PC-12细胞活力呈时间和剂量依赖性下降及细胞凋亡，可认为20μmol/L Aβ25-35干预24小时可作为较理想的AD细胞型。 关键词：β-淀粉样蛋白；PC-12细胞；AD 随着社会老龄化，阿尔茨海默病(AD)作为老年人群中常见的神经退变性疾病，对人类生活质量的影响日趋明显。AD以大脑皮质获得性高级功能受损为主要临床特征，β淀粉样蛋白(amyloid beta protein Aβ)及其聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病特异性病理学变化，被认为是AD发病的重要环节和各种病因的共同通路[1]。本研究拟通过Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡以明确AD细胞模型的适宜条件。 材料与方法 一、材料 1.试剂Aβ25-35、二甲基亚矾(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)均为美国Sigma公司产品；其余均为国产分析纯试剂。 2.仪器 倒置相差显微镜由日本Olympus 公司购进；恒温CO2培养箱美国Thermo公司；FACSCalibur流式细胞仪由美国Becton Dicknson公司购进；多功能酶标仪由德国BMG 公司购进。 二、实验方法 1、细胞培养、分化 PC12细胞由西安交通大学环境与疾病实验室提供，于10%胎牛血清DMEM培养液，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。1-2天更换培养液，培养至单层细胞汇合后传代。 2、Aβ25-35溶解后配成0.5mg/ml溶液，37℃孵育，-20℃保存备用，使用前稀释、过滤。 3、MTT细胞活力检测 取对数生长的PC12细胞，至96孔细胞培养板中，贴壁后将不同浓度Aβ25-35（1μmol/L 、10μmol/L 、20μmol/L 、50μmol/L、100μmol/L）加入，并设立阴性对照和空白对照。于24h或48小时后给予5g/L MTT20μL孵育4小时，弃上清加100μL二甲基亚砜（DMSO），在酶联免疫检测仪570nm波长下测定各孔光吸收值，并将其与正常对照组吸光度的比值作为相对细胞活力。 4、细胞形态观察 使用倒置显微镜分别于给药6小时、12小时、24小时、48小时观察细胞形态。 5、流式细胞仪测定细胞凋亡 应用AnnexinV-Pl双染色检测细胞凋亡。细胞按1×105/孔的密度接种在6孔板中，给予Aβ20μmol/L干预6、12、24、48 h后，用PBS洗涤2次，每孔加人500μL反应缓冲液、2μL FITC和1μL PI，室温避光反应15分钟，应用流式细胞仪检测。 6、统计学处理　数据处理采用方差分析统计。 结果 1、Aβ对PC12细胞活力的影响 　MTT检测结果显示，Aβ对PC12的细胞毒性作用与浓度密切相关。当不同浓度为的Aβ作用于PC12细胞后，其细胞活力呈浓度依赖性下降趋势(P≤0.05)，高浓度Aβ对细胞有明显毒性作用，随浓度减低细胞毒性作用减小(见表1)。 表1 不同浓度Aβ25-35对PC12细胞存活率的影响 浓度（μmol/L） 样本量 细胞活力（%） 1 4 89.46±2.32* 10 4 58.72±3.53* 20 4 52.01±2.64* 50 4 42.27±4.29* 100 4 33.41±4.18* *注：与对照组比较，P0.05 2、细胞形态观察 在倒置显微镜下，刚接种的PC12细胞为散在分布的透亮且体积较小圆形细胞，经培养12小时后大部分细胞贴壁且长出短小突起。24小时后细胞为梭形，边界清楚，胞浆丰富。在 Aβ作用下出现细胞凋亡增加，表现为胞体缩小变圆，边界模糊，细胞核固缩，细胞突起中断。随着处理的时间增加，细胞胞体变小，呈空泡状，突起完全消失(见图1)。 图1 Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡细胞形态（×400） A：10μmol/L(24h) B：20μmol/L(24h) C：50μmol/L(24h) 3、Aβ对PC12细胞凋亡率的影响　20μmol/L Aβ干预6、12、24小时后测定PC12细胞凋亡。流式细胞仪检测结果显示，正常对照组细胞集中在3区，凋亡率为2.17±0.21%；20μmol/L Aβ作用6小时后出现明显细胞凋亡，12小时后凋亡率为6.21