NusA融合表達型T载体的构建及其应用研究.doc

NusA融合表达型T载体的构建及其应用研究 浙江工业大学药学院 胡栋栋 陈洁虹 摘要： NusA作为N端标签的编码基因能提高在大肠杆菌中难溶的重组表达蛋白的可溶性。本课题以PCR法扩增大肠杆菌NusA的编码基因，将其重组于实验室现有的融合表达型T载体中，从而获得以NusA为担体蛋白的融合表达型T载体。目的基因的PCR产物可直接与经XcmI酶切的T载体连接，获得的表达型重组质粒转化表达宿主即可得到某个目标蛋白的基因工程菌。本课题以D-海因酶基因为应用研究的实例。 关键词：Nusa PCR 双酶切 感受态 D-海因酶基因 前 言 NusA融合蛋白表达系统于9年前（1999年）由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难溶的重组表达蛋白的可溶性。NusA融合蛋白表达系统面市至今，已经通过一些高通量表达筛选的评估确认其在可溶性改善方面的有效性。各种“难溶蛋白”与NusA标签重组表达显著提高可溶性在众多NusA标签融合蛋白可溶性研究报告中，有不少文章因为其研究所涉及的蛋白的数量多和异源性范围广而得到研究者的重视。文献资料表明NusA具有很好的增溶效果，以NusA为融合伴侣的融合蛋白溶解性好，容易正确折叠，从而可以获得较高生物学活性的的目标蛋白。NusA标签提高蛋白可溶性的可能机制:Houry等揭示NusA蛋白是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。而 GroEL与其共作用因子GroES是大肠杆菌唯一的在所有生长条件下必需的分子伴侣系统。Douette等研究了融合蛋白NusA- UCP1的可溶产量。UCP1是一种线粒体膜蛋白。这些作者发现16℃培养时，当GroEL共过表达的情况下， 融合蛋白的可溶性有更大的提高。这个结果也表明NusA与分子伴侣途径相作用，从而阻止参与蛋白的聚集。 T载体是一种克隆载体，也就是用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。它不能大量表达。多用于克隆PCR产物，一般用一些常见的载体改造成的，一般的DNA聚合酶没有3-5核酸外切酶活性，即酶的校正活性，在PCR产物3末端以非模板依靠方式加上一个腺苷酸残基（A），这样PCR产物的3腺苷酸可和T-载体的3胸腺嘧啶互补，T-载体系统入行有效连接的基础正是这种碱基配对作用。相反，有校正活性的聚合酶将移去这个3突出端，产生平端PCR产物，这种产物不能直接用T-载体系统进行克隆。 假如想要一PCR扩增基因的产物大量表达，常见的方法是先将PCR产物连入T载体扩增（所用T载体需事先设计好酶切位点），再用相应酶切下目的片段，然后连入以同样酶切处理后的表达载体大量表达蛋白质。T载体用于重组目的基因，具有简单、快速、高效的特点。目的基因的PCR产物无需纯化、酶切即可重组至载体中。目前市场上提供的T载体为克隆型T载体，不能满足表达的需要，获得表达型T载体具有广阔的应用前景。 2材料与方法 2.1 实验材料： 2.1.1质粒载体及菌株：大肠杆菌DH5α菌株，实验室构建的CT载体 2.1.2酶及主要试剂： pfu DNA聚合酶，AflⅡ限制性内切酶, NdeⅠ限制性内切酶 2.1.3培养基：LB培养基（0.5%Yeast Extract,1%Tryptone,1%NaCl） 2.1.4引物 根据基因序列，按照引物设计原则用引物设计软件DNASIS设计引物，委托上海生工合成。以下为所设计的两条引物序列： 正向引物hddA1:5AATCATATGAACAAAGAAATTTTGGCTGT3 反向引物hddB1:5AAACTTAAGCTCGCTTCGTCACCGAACCAG3 2.2方法 2.2.1目的基因的制备： 引物的设计 从基因库网站 HYPERLINK / /上搜索出Nusa基因的DNA序列: ttacgcttcgtcaccgaaccagcaaatattacgggcagccataatcagtgctccggctttttcgtcggtcaacccttcgatatcagccagatcatcaatgccctgttcggcgagatcttccagcgtacaaacgccacgggcggccagtttgaatgccaaatcacgatctaccccttcaaggttcagcagatcgtcagccggtttgttatcaccgaggctttcttcctgggcctgtgcaatggtggccagtgcatttttagcacgctcgcgcagtgcttcaacggtcggctcatcaaggccttcgatttccaacagctctttcatcggcacataggccaattcttccagcgtcgagaagccttcttctaccagaacagtcgcgaagtcttc