6_第六章__基因的转移与重组体的筛选和鉴定解读.ppt

　　原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。 　　实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞 此法的基本原理是，将包裹着DNA的金粒或钨粒，通过基因枪(gunpowder)、氦气 (helium gas)或电击(electric discharge)等技术来获得足够的加速度，射入完整的植株、组织外植体(tissue explants)、愈伤组织或细胞悬液。 生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一 精子进入卵细胞后，尾部消失，头部变圆膨大，形成雄原核；卵细胞完成第二次有丝分裂后，其细胞形成雌原核。雄原核与雌原核接触，各自的核股消失、融合，二性染色体在其后的台子分裂中混合、配对，受孕宣告结束，一个新生命宣告开始。受精过程约需24小时。 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 先将实验植物材料，例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒，用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片，即所谓叶盘，然后接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。这种经接种处理的叶盘，在饲养平皿的滤纸上培养2天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基(shooting emdium)中，进行筛选与再生，接着再转移到“生根培养基”(rooting medium)上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽在土壤中 ，叶盘转化法适用性广，对那些能被根瘤土壤杆菌感染的、并能从叶片外植体再生植株的各种植物都可适用。这种方法操作方便简单，获得转基因植株的周期短并具有很高的重复性，便于在实验室内进行大量常规培养。共培养法，是指将毒性的根瘤土壤杆菌，同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共同培养，以便促使植物细胞发生转化。 URA3、HIS3、LEU2、TRP1、LYS2 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 二、根据插入基因的表型选择 1. 弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 例：抗生素抗性 抗性基因 载体 外源DNA 连接 转化 受体菌 抗生素培养基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生长 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 1. 直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 三、 DNA电泳检测法 Marker 载体 重组克隆 2. 酶切电泳筛选法 根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。 一般用重组时的内切酶将外源DNA切出 单 双 四、PCR扩增检测法 应用PCR反应扩增出预期DNA片断 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）； （2）用外源DNA插入片断引物作PCR； （3）凝胶电泳； （4）是否有条带产生，条带大小是否正确。 五、核酸杂交检测法 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。 2. Northern blotting 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交。 3. Western blotting 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 ①（SDS） 点样 电泳方向 膜 胶 蛋白 ② 转膜 ③ 杂交 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 ④ 检测 3. Western blotting 4. 原位杂交筛选 利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。 六、免疫化学检测法 对表达产物的检测。蛋白－蛋白“杂交” 放射性抗体检测 与菌落杂交相似 DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。 七、DNA序列分析 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （Luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 植物转化体报告基因（reporter gene)筛选 报告基因：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。 （1）获得目的基因； （2）目的基因与载体的酶切与连接；