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【2017年整理】杯碟法检测方法090626-新
杯碟法检测青霉素酶的方法(试行)
1.适用范围
本方法适用于原料奶、灭菌乳、乳饮料中青霉素酶的检测。
2.实验原理
青霉素酶能够破坏青霉素对藤黄微球菌的抑制作用,而舒巴坦能特异性地抑制青霉素酶的这种作用,在样品中先后加入适量的舒巴坦和青霉素,采用杯碟法通过测定抑菌圈大小差异来检测样品中的青霉素酶。
酶活单位(Active Unit):在室温(25℃)下,1min分解1
3.试剂与材料
除另有规定外,所有试剂为分析纯,水为GB/T6682-2008规定的三级水。
3.1 菌种:藤黄微球菌(Micrococcus Luteus),菌种号CMCC(B)28001。
3.2 青霉素酶标准品:纯度≥90%,酶活1200IU/mg(≥1000万青霉素效价单位),4℃
3.3 舒巴坦标准品:纯度89.2%,4℃
3.4 青霉素G:色谱级,纯度97%(分析纯需适当增加标准工作溶液浓度),密封避光,防潮,4℃
3.5 磷酸二氢钾(KH2PO4):纯度99.5%。
3.6 磷酸氢二钾(K2HPO4):纯度98%。
3.7 氯化钠(NaCL):纯度99.5%。
3.8 磷酸盐缓冲溶液(pH6.0):取8g磷酸二氢钾(3.5)和2g磷酸氢二钾(3.6),用1000ml水溶解,121
3.9 生理盐水:称取8.5g氯化钠(3.7),溶解于1000ml水中,121℃
3.10 青霉素酶标准储备溶液:准确称取(精确至0.001g)青霉素酶标准品(3.2)用生理盐水(3.9)溶解并稀释,配成酶活力为1000IU/ml的标准储备溶液,4℃保存。可使用
3.11 青霉素酶标准工作液:用生理盐水(3.9)将青霉素酶标准储备溶液(3.10)稀释配制成酶活力为1IU/ml的标准工作溶液,需当天配制使用。
3.12 舒巴坦标准储备溶液:准确称取(精确至0.001g)舒巴坦标准品(3.3),用磷酸盐缓冲液(3.8)溶解并定容为10mg/ml。4℃保存。可使用
3.13 舒巴坦标准工作溶液:用磷酸盐缓冲溶液(3.8)将舒巴坦标准储备溶液(3.12)稀释配制成浓度为1mg/ml,需当天配制使用。
3.14 青霉素G标准储备溶液:准确称取(精确至0.001g)青霉素G(3.4),用磷酸盐缓冲溶液(3.8)溶解并定容为1mg/ml,4℃棕色瓶中保存,可使用1-2个月
3.15 青霉素G标准工作液:取青霉素G标准储备液(3.14),用磷酸盐缓冲液(3.8)稀释,配制成浓度为10μg/ml,4℃
3.16 空白奶粉:脱脂奶粉
3.17 灭菌脱脂乳:使用脱脂奶粉(3.16)按GB/T4789.27-2008中4.2执行(10g奶粉+90ml水,113℃灭菌
3.18 菌种培养基:LB营养琼脂
3.19 抗生素Ⅰ号培养基
4.仪器与设备
4.1 天平:精确到0.001g
4.2 冰箱:4
4.3 恒温培养箱:36℃±
4.4 恒温水浴锅:55℃±
4.5 恒温干燥箱
4.6 高压灭菌锅
4.7 抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺(精确到0.1mm)
4.8 旋涡混匀器
4.9 移液枪:20-200μl、100-1000μl、1000-5000μl
4.10培养皿:内径90±0.5mm,皿底平整光滑,厚薄均匀无凹凸现象。
4.11牛津杯:不锈钢管,外径(7.8±0.1mm),内径(6.0±0.1mm),高度(10.0±0.1mm)。
4.12陶瓦盖:内径110mm,外径116mm,高度26mm
5.检测步骤
5.1试样制备
5.1.1液体奶:取奶样25g,混合均匀,待处理。
5.1.2酸奶:取酸乳样品25g,经生理盐水1:1稀释,混合均匀,待处理。
5.1.3 阴性对照样品:灭菌脱脂乳
5.1.4阳性对照样品:移取青霉素酶标准工作液加入到灭菌脱脂乳中,混合均匀配制成酶活力为0.1IU/ml的阳性对照样品,4℃
5.2试样处理
5.2.1取试样900μl分别放入A、B、C、D四个2ml离心管中,加入以下配置(加样顺序按试剂排列顺序):
A:加50μl舒巴坦标准工作溶液,再加入50μl青霉素G标准工作溶液。
B:加50μl舒巴坦标准工作溶液,再加入50μl磷酸盐缓冲液。
C:加100μl磷酸盐缓冲液。
D:加50μl青霉素G标准工作溶液,再加入50μl磷酸盐缓冲液。
将上述混合液用涡旋混匀器充分振荡混匀,室温放置1小时后检测。
同时做阴性对照和阳性对照样品各一组。
5.3菌悬液的制备及用量
将菌种接种于菌种培养基斜面试管中(工作菌株正常使用传代数为3-10代,一般可使用1-2个月),36±1℃培养22-24h。使用4ml生理盐水将经过培养的新鲜斜面培养物洗下,混合均匀,得到菌悬液(含菌量大约1*109CFU/ml)。将菌悬液以2%的比例加入到LB营养琼脂中,菌悬液中含菌量的多少,以能使0.5μg/
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