【2017年整理】浙江大学生物化学实验甲 -酵母蔗糖酶的提取原理.docVIP

PAGE PAGE 1 酵母蔗糖酶的制备原理 一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介 蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包 酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。 酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃ 二、酵母蔗糖酶的分离纯化 本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀， DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。 前三步分离纯化的原理如下： 离心 离心 上层：脂溶性物质 酵母细胞 破细胞 中层（水层）：蔗糖酶，可溶性杂质等 缓冲液 石英砂 研磨 下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等 保温30分钟 取中层 （水层） 使热不稳定蛋白变性 50℃ 离心 上清：蔗糖酶、可溶性杂质等 沉淀：变性蛋白 离心 取上清 使蔗糖酶沉淀 加等体积95%乙醇 上清：杂蛋白及可溶性杂质等 冰浴中20分钟 沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等 ㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理 离子交换柱层析分离混合物的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的 阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。 离子交换层析是一种液-固相层析技术。其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点： （溶液中离子 （溶液中离子） 阴离子交换剂 选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径 越小越易结合。 遵循质量作用定理：对某一特定离子，随 离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。 由于离子与交换剂的结合具有上述特点，因此如混合物中的各组分具有不同的电荷性质，或虽然电荷性质相同，但电荷数不同，则各组分与离子交换剂的静电结合能力就不同。与交换剂上带电基团电荷性质相反，带电荷数目越多的离子越容易吸附在交换剂上，带电数目越少，结合能力越弱。如离子所带的电荷与交换剂上带电基团的电荷性质相同，则完全不能结合于交换剂上，经洗脱液洗脱后，各组分即按离子结合能力由小到大的顺序依次洗脱出来，从而达到分离混合物的目的。 当用离子交换层析分离生物大分子如蛋白质、核酸时，由于生物大分子（蛋白质）常为两性电解质，在不同的pH条件下，组成蛋白质的AA解离情况不同，导致蛋白质具有不同的电荷性质和电荷数目，因此可通过调节溶液的pH，使待分离的蛋白质混合物选择性地吸附于离子交换剂上，再通过改变洗脱液的离子强度和pH，控制这种结合能力，从而使蛋白质混合物按结合能力由小到大的顺序依次从层析柱中洗脱下来。 本试验用pH7.3 0.02 mol/L的Tris-HCl缓冲液进行0～0.5mol/L NaCl的线性梯度洗脱，在该条件下（高于酶的等电点），酵母蔗糖酶带负电荷，因此当用阴离子交换剂（DEAE-Sepharose）进行分离时，酵母蔗糖酶结合于离子交换剂上，通过改变洗脱液中盐浓度的方法即可将酵母蔗糖酶洗脱下来。 离子交换DEAE-Sepharose柱层析的流程 ⑴、离子交换剂的准备 即将离子交换剂变成适于分离各类离子的形式，主要包括以下几步处 理： a、除去交换剂中的杂质和使交换剂溶胀 通常用0.5N的HCl和0.5N的NaOH处理，对阳离子交换剂先用NaOH 洗，然后用HCl洗。对阴离子交换剂则相反。处理时间每次均为30min，每次洗涤后，均要用大量水洗至中性。通过此步，一方面可除去牢固吸附在交换剂上的杂质，另一方面可使交换剂充分