【2017年整理】现代生化技术实验讲义(生工10).docVIP

PAGE PAGE 12 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 一、实验目的 了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理；熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。 二、实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4 三、材料与试剂 硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白 双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。此试剂可以长期保存。 10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。 待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。 实验器材：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计。 四、操作方法 1、标准曲线的制作 在6支刻度试管中，分别按下表所示量加入各种试剂，振荡均匀混匀。室温下反应30min后，用0号管校零，测定各管在540nm波长下的吸光度，以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。 试剂 加入量（ml） 0 1 2 3 4 5 标准蛋白溶液 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.05mol/lNaOH 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2、样品蛋白质含量的测定 在刻度试管中加入蛋白样品溶液1m，双缩脲试剂4ml，室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度，从标准曲线查出样品蛋白质含量。平行测定三次，计算平均值。 五、结果与讨论 根据上述实验结果，绘制蛋白标准曲线，计算未知蛋白样品溶液浓度，并将相关实验数据填入下表： 标准蛋白浓度 吸光度 样品测定吸光度 样品蛋白浓度 平均值 样品蛋白浓度 六、思考题 双缩脲法测定蛋白的原理是什么？操作过程中应注意哪些问题？ 实验二 旋光法测定味精的纯度 一、实验目的 掌握旋光法测定生化物质的基本原理，熟悉旋光仪的仪器构造，掌握旋光仪的使用方法。 二、实验原理 味精在2M盐酸溶液中以谷氨酸形式存在。此时，纯谷氨酸的比旋光度为20。在一定温度下测定样品的旋光度，与该温度下纯L－谷氨酸的比旋光度比较，可计算出味精的纯度。 三、材料与试剂 分析纯盐酸、味精样品、旋光仪 四、操作方法 1、样品溶液配制 精确称取味精样品10.00g，加40－50ml蒸馏水溶解。搅拌下加入分析纯盐酸16ml，使味精全部溶解。冷却至室温，全部转入100ml容量瓶，蒸馏水定容至刻度。 2、旋光仪零点校正 打开电源开关，经预热10min，使钠光发出稳定的光。取16ml分析纯盐酸，用蒸馏水定容至100ml。装满样品室，调整零点。 3、样品液测定 用样品液洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，打开开关，记录旋光仪的读数。并记录测定时刻该样品液的温度。 五、结果与讨论 1、L－谷氨酸的浓度C计算 根据测定的旋光度a，利用下式计算样品液中L－谷氨酸的浓度C。 式中： C——谷氨酸的浓度，即100ml样品中，所含L－谷氨酸的克数。 a——测得的旋光度 L——旋光管的长度，dm [a]tD：测定温度为t℃时，L－谷氨酸的比旋光度，按 [a]tD＝32 ＋ 0.06 ×（20－t）进行计算。 2、味精纯度的计算 根据样品中L－谷氨酸的浓度，由下式计算样品中味精的纯度： 将相关实验结果和计算结果填入下表中： 温度 t（℃） 旋光管的长度 L（dm） [a]tD 旋光度a C （g/100ml） 味精纯度 （%） 注：味精纯度是指一水合L-谷氨酸一钠（分子量187.13）的含量。在盐酸介质中通过比旋光度测出的为L-谷氨酸（分子量147.13）的浓度，因此计算时需进行换算。 六、思考题 旋光法测定生化物质的原理是什么？  实验三 荧光光度法测定氨基酸 一、实验目的 掌握荧光分析法的基本原理，熟悉荧光光度计的仪器构造，掌握荧光光度计的使用方法。 二、实验原理 荧光试剂邻苯二甲醛（OPT）在碱性介质中，在还原剂β-巯基乙醇的存在下，与氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸不反应）反应，生成强荧光化合物1-硫代-2-烷基异吲哚，在波长为340nm的紫外光激发下，产生波长为455nm的荧光，通过测定荧光强度可以确定氨基酸的含量。 三、材料与试剂 5μg/ml硫酸奎宁溶液：用0.05mol/L硫酸配制； pH 9.5 硼酸缓冲溶液：准确称取硼酸2.4740 g 溶于水并稀释至100 ml，再用2 mol/LNaO