【2017年整理】发酵教学大纲-2.docVIP

微生物工程工艺原理实验大型综合实验 综合性实验1　小型发酵罐的使用与微生物发酵过程及其条件控制 （一）实验类型：综合型 （二）实验类别：基础实验 （三）实验学时数：20 （四）实验目的 1. 了解小型发酵罐的基本结构。 2. 掌握发酵罐的使用及其大规模培养微生物的方法。 3. 巩固微生物发酵生产目的产物的工艺流程与基本操作。 （五）实验内容 1、微生物的种子培养 2、发酵罐各种配件的安装 3、培养基的消毒处理 4、发酵工艺的调控 5、发酵液预处理及发酵产物的分离 6、目的产物检验 （六）完成综合性实验报告 1）种子培养基的制备过程及培养 2）发酵罐的组成部分及其功能 3）发酵罐灭菌的操作步骤及注意事项 4）发酵罐发酵 （1）接种方法及注意事项 （2）发酵罐的操作记录:每隔8h的溶氧、pH值变化情况、泡沫情况，补料后的溶氧、pH值变化情况； （3）发酵预处理与过滤速率的关系； （4）不同pH预处理清液的抑菌效果； （5）不同pH处理沉淀乙醇提取液的抑菌效果。  实验二　微生物的诱变育种 一、实验类型：综合型 二、实验学时数：15 三、实验目的 加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识； 学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神； 巩固工业微生物提高微生物目的代谢产物生产能力的途径； 四、原理 优良菌株的选育的目的是防止菌种退、解决生产实际问题、提高产品质量和开发新产品。诱变育种是提高微生物目的代谢产物生产能力的重要途径。选育的方法主要有基于基因突变的自然选育和诱变育种以及基于基因重组的杂交、原生质体融合、基因工程等。诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育普遍使用的一种主要方法。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。微生物代谢产物相关的突变多数是产量降低的负突变，少数是生产能力提高正突变。以物理、化学方法进行诱变，再经过初选、复选及产物测定获得高产突变菌株，并以此作为再次诱变的出发菌株。 五、试剂溶液与器材 菌种：Act0988菌株斜面菌种。 高氏一号培养基成分、牛肉膏、酵母膏、甘油，大豆粕、玉米淀粉、α-淀粉酶、酵母膏、琼脂、蒸馏水、0.5%酪蛋白、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸度计。 三角瓶(250mL、500mL)、20×200试管、培养皿(90mm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外灯、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、1mL移液枪10把、50或100μL移液枪10把（相应枪头100个）、曲玻棒、酒精灯。 六、实验内容： 1．Act0988出发菌株活化培养、加富培养基培养 斜面菌种先接种于新鲜的高氏一号培养斜面28℃培养6d，然后将培养的斜面的菌丝体接种于加富高氏一号培养基，加富高氏一号培养基除高氏一号基础成分外添加牛肉膏2g/L、酵母膏2/L及甘油2mL/L℃培养6d。 2．单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。 其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。若诱变剂产生的突变只在 DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟 (phenotypic lag) 。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。 无菌室以生理盐水（0.85%NaCl）洗下斜面孢子收集于装有近20粒无菌玻璃珠三角瓶内(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，涡旋器上打散未分离的孢子，然后用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬浮液，再用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释调整孢子浓度至106～108个/mL，冷冻保藏备用。 3．诱变处理 1）紫外线诱变 打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为