【2017年整理】发酵法生产透明质酸.docVIP

发酵法生产透明质酸 透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分， 透明质酸的提炼的方法有三种组织微生物发酵化学合成组织化学合成HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。 一.发酵部分： 经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块： 1.菌种的筛选 2.菌种的诱变 3.培养基配方的优化 4.菌株的最佳培养条件 首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。 下面我将针对这几个模块分别做详细的叙述与分析。 菌种的筛选： 优良的微生物菌种是发酵工业的基础，得到这类产物的两个成功要素在于产生菌的选择和筛选方案的确定。以目的代谢物透明质酸为目标筛选出能产生它的菌种是前提，设计出科学合理的筛选方案是事关筛选工作成败的关键。菌种初筛方法必须快捷、简便、有效，才能一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰掉，把少量有用的微生物筛选分离出来。经研究发现在牛鼻粘膜上分离到的HA产生菌种即乙型溶血性链球菌比较适合用来发酵。 1.1筛选步骤： 牛鼻粘膜--稀释分离涂平板--初筛菌株--复筛摇瓶发酵--发酵液离心--上清液乙醇沉淀--定性分析--获得目的菌株--斜面培养 1.2 菌种筛选操作方法： 1.2.1 初筛： 将牛鼻黏膜用0．1％蛋白胨溶液分成梯度涂于血琼脂平板，37℃，培养24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态，用接种针挑起看其黏度。荚膜染色并镜检。 1.2.2 荚膜染色 抹片自然干燥，甲醇固定，以久贮的多色性美蓝液做简单染色。荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。菌落选择的依据：产生HA的菌落透明度很高，隆起，呈水滴状色泽近似蛋清。 1.2.3 复筛 发酵摇瓶中接人初筛疑似菌株，每株五瓶，在200 r/min、37℃下培养24h。取复筛发酵液100ml，离心4000 r/min，20min。上清液用三倍体积无水乙醇沉淀。沉淀物用红外吸收光谱作定性分析。 1.2.4 红外吸收光谱法 取HA 2mg，KBr压片，用IR一400红外分光光度计在4000—5000m-1范围内扫描。 发酵液提取物的红外吸收图谱在3400 cm-1附近有强的OH伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900 cm-1附近有CH2的伸缩振动，1620cm-1及1560cm-1附近有CO、CN的伸缩振动，表明存在着乙酰氨基结构；在1400cm-1和1320cm-1附近有COC的伸缩振动和OH的弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上解离羧基结构和多糖羟基结构。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。 测定 通过测定各种物质的含量来判断筛选结果是否正确。 (1)HA中葡萄糖醛酸含量的测定。参照硫酸-咔唑法进行测定。 (2)菌体量的测定：采用紫外可见分光光度计法，将培养液稀释后，在660nm处测其OD值。 (3)HA含量测定：采用Bitter-Muir氏法。以葡萄糖醛酸标准品为对照，测得样品溶液中葡萄糖醛酸的含量。由于葡萄糖醛酸的含量占整个产量的48．38％，因此测得葡萄糖醛酸的含量除以48．38％，再乘以稀释倍数就可以得到HA的产量。 (4)葡萄糖含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸法。 (5)蛋白质含量：参照考马斯亮蓝法测蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)标准品做对照。 (6)相对分子质量测定：采用粘度法。使用0．5-0．6mm的乌式粘度计，参比液为0．2mol／L氯化钠，测定温度30℃，三点外推出特性粘数[μ]，根据公式[μ]=3.6x10-4Mr的0.78次方，计算出产品的平均相对分子质量Mr。 菌种的诱变： 以链球菌为例，野生型的链球菌多会产生溶血素(Streptolysin)，溶血素混入成品HA，会使HA的品质降低。一般情况下不会超过2g/L，得到的HA分子量也很低,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。因此必须经过诱变等手段获得HA产量高、优良性状稳定的菌株。诱变菌种的常规方法是以紫外线和γ射线为诱变剂的物理诱变方法和化学试剂如