层析法[精选].ppt

K（分配系数） 在吸附层析 K为吸收平衡系数 分配层析 K为分配系数 离子交换层析 K为交换系数 亲和层析 K为亲和常数 Vt：层析柱的总体积 Vo：是层析柱内凝胶颗 粒间空隙的总体积， 也称为外水体积 Vi：为层析柱内凝胶颗粒 微孔的总容积，也称 为内水体积 Ve：某一物质从层析柱内 完全被洗脱下来时所 需洗脱液的体积 Vt=Vo+Vi 用亲和标签纯化融合蛋白 ▲耐压能力增强,流速加快 ▲耐腐蚀能力增强(耐有机试剂,脲,盐酸胍等) ●分离 分子量相差较大的蛋白质(至少差20-30kD) ●蛋白质纯化过程中的除盐 常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25 ●蛋白质分子量的测定 ●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否 凝胶过滤层析的用途 proteins salts Desalting proteins ? ● 凝胶介质的处理 1份凝胶加十份水 自然溶胀至少24小时 将上清中细小的凝胶碎块弃除 沉淀后再次弃去凝胶碎块 重复数次直到液相澄清为止 为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用 凝胶过滤层析的基本操作 装 柱 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50-100:1 柱体要垂直，关闭下口，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液 将缓冲液中的凝胶搅拌均匀沿柱一侧缓慢并连续地 一次性注入柱内 装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝 可用2 ml蓝色葡聚糖溶液过柱检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。如有裂纹或色带变形即为失败,须重装柱 检查装柱是否成功 对样品的要求 浓缩 体积约为10-20 mg/ml 过滤 0.2 mm孔径滤膜过滤或10, 000 g 离心5 min 上样量 不超过柱床体积的1-5 % 注意: 操作时避免破坏柱体表面,尽量保持表 面均匀平整 上 样 离子强度 洗脱液应保持一定的离子强度 (0.02mol/L-0.2 mol/L)，以保 证蛋白质不与凝胶介质结合 洗脱速度 1ml/min左右，低流速可提高分 辨率.高流速不仅减低分辨率, 而且可造成堵塞柱子引起分离失败 洗 脱 分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同 凝胶柱的再生与保存 再生 用3-5个柱床体积缓冲液洗涤柱体 ↓ 用0.2 mol/L NaOH或1 mol/L NaCl洗涤 ↓ 用非离子型去垢剂0.2-1% NP-40去除 吸附过紧的杂质 保存 0.02% NaN3(抑菌剂)保存在20 %乙醇中保存 是蛋白质分离纯化的最有效方法之一 有时一步纯化即可完成纯化工作 亲和层析（ affinity chromatography） 基本原理 亲和层析是利用一些生物分子和其配基之间有特 殊的 亲合力，如抗原和抗体、酶蛋白和辅酶等，它 们在一定条件下能结合为复合物。如果能将复合物 中的一方固定在固相载体上，就可从溶液中纯化另 一方 亲和色谱图 亲和层析的优缺点 优点 特异性强 简便