课题2__多聚酶链式反应扩增DNA片段剖析.ppt

4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在—20 ℃储存 一、PCR的原理（1、体内DNA的结构 ） T 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ A DNA分子的-OH端为3/ ; 磷酸基团的末端为5/ 。 * * DNA的立体结构  ——双螺旋结构 多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR技术) 一种在体外快速扩增DNA的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 美国科学家　 穆利斯 发明了PCR技术　 1993年诺贝尔奖 ★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 ㈠.DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1.元素组成： 脱氧核苷酸 2.基本单位: 一.基础知识 脱氧核苷酸 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 A G C T 1 2 3 4 5 O A T G C A G C T 3、DNA分子的平面结构 氢键 5端 3端 5端 3端 1、 条件： ① 模板： 亲代DNA的两条母链 ② 原料： 游离的四种脱氧核苷酸 ③ 能量： ATP ④ 酶： 解旋酶 、DNA聚合酶 ⑤ 引物：能与DNA母链的一段碱基序列互补配对 （二）．细胞内DNA复制的过程 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、过程 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶 TaqDNA聚合酶 不需要 催化合成DNA子链 能量 ATP 不需要 引物 一般是一小段DNA 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 二、PCR技术原理 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、步骤：变性 ——复性——延伸 PCR循环--变性 95℃变性 PCR循环--变性 95℃变性 PCR循环--变性 95℃变性 PCR循环—复性 55℃复性 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程总结： 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 实验步骤： 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10S 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 四、操作提示 操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 目的： 避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。 （一）理论上DNA扩增数目的计算 五、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收