【2017年整理】实验讲义-酶制剂生产与应用.docVIP

PAGE PAGE 6 尼龙固定化木瓜蛋白酶 一、目的： 了解共价交联法固定酶的原理和步骤 二、原理 尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。 ? 三、实验材料、仪器和试剂 1、材料 尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm 2、仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱 3、试剂 (1)18.6%CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液 (4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5 (6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。 (11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。 四、操作步骤 1、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。 (2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。 (4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。 (5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。 2、酶活力测定 A．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液 B．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液 C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液 取三支试管按上述加入反应液，37℃ 三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外） 五、结果计算 1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。 2.酶活回收= 六、注意事项 (1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。 (2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。 (3)酶活性测定的反应时间一定要准确。 实验二、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及其活力测定（4课时） 实验类型：综合性 实验目的： 掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力测定的基本原理和基本操作。 实验内容： 1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。纱布过滤，滤液在4℃ 2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9左右。置4℃10分钟。（2）4 3．脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物，吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活力大小。 实验要求： 提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算： 1）提取制备脲酶的收得率： 2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数 试管号 步 骤 1 2 3 （1）酶液（mL，原液或适当稀释） 0 0 1.00 （2）标准硫酸铵溶液（mL） 0 0.30 0 （3）蒸馏水（mL） 2.00 1.70 1.00 （4）10%· 三氯乙酸 (mL) 1.00 1.00 0 （5）室温平衡5 min。 （6）3%尿素（mL） 1.00 1.00 1.00 （7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸 1.00 mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液置于EP管