多酶交替降解殼聚糖及其酶解产物分子量分布的研究.docVIP

多酶交替降解壳聚糖及其酶解产物分子量分布的研究 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是迄今发现的唯一的天然碱性多糖，能溶于醋酸等有机酸，具有良好的生物相溶性，且无毒，可生物降解。壳聚糖分子中有胺基和羟基，容易进行化学改性和修饰，因此在医药、纺织、饲料、食品、化工、生物、农业等众多领域具有重要的应用价值[1-3]。但是，由甲壳素脱乙酰化制得的壳聚糖分子量大，具有紧密的晶体结构，不溶于普通溶剂，只能在某些酸性介质中溶解，这使其应用受到了极大限制。此外，分子量对壳聚糖性质也有很大影响，不同分子量的壳聚糖性质差异很大，有时甚至表现出截然相反的特性，而壳聚糖的许多独特功能只有在分子量降低到一定程度才表现出来。降解壳聚糖的方法主要有物理、化学和酶降解法。酶降解法通常优于其它方法，这是由于酶法降解可特异性地、选择性地切断壳聚糖的β-1，4糖苷键，降解过程和降解产物的分子量易于被控制，且条件温和。目前，国内研究多用单一酶或是用混合酶直接降解壳聚糖，用多酶交替降解却不多见。本试验用甘露聚糖酶和纤维素酶交替降解壳聚糖，再用凝胶渗透色谱直接测定壳聚糖的相对分子质量分布[4]。1 材料与试剂1.1 菌种里氏木霉（Trichoderma reesei）FT04-18和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）FB04-25均由华中农业大学发酵工程研究室保藏。1.2 仪器752紫外光栅分光光度计（由上海精密科学仪器有限公司生产）、HH-4数显恒温水浴锅（由江苏金坛市荣华仪器制造有限公司生产）、旋转蒸发仪（由上海亚荣生化仪器厂生产）、超声波破碎仪（由宁波海曙金达超声波设备有限公司生产）、乌氏粘度计(由成都科析仪器成套有限公司生产)。1.3 试剂粉状壳聚糖：脱乙酰≥90％，由国药集团生产。壳聚糖胶体溶液：在3 g壳聚糖中加入75 ml的1%醋酸溶液，85 ℃水浴中放置10 h至完全溶解，再用1%醋酸定溶至100 ml，4 ℃冷藏。葡聚糖分子量标样：Dextran T-10，Mw（分子量）=10 000；Dextran T-40，Mw=40 000；Dextran T-70，Mw=70 000；Dextran T-500，Mw=500 000。分子量标样均由Pharmacia公司提供。1.4 培养基产纤维素酶固体培养基：稻草60 g、麸皮40 g、KH2PO4 0.05 g、CaCl2 0.05 g、MgSO4 0.25 g、(NH4)2SO4 1.8 g、NaCl 0.1 g、V水：V物料=1：2.2、吐温-80 1%，pH值自然。产甘露聚糖酶一级种子培养基：胰蛋白胨10 g/l、酵母提取物5 g/l、NaCl 5 g/l，加入2%魔芋精粉，灭菌，pH值7.4。产甘露聚糖酶二级种子培养基：胰蛋白胨10 g/l、酵母提取物5 g/l、NaCl 5 g/l，加入8%诱导物(诱导物制备：在13%魔芋溶液中加入2%的甘露聚糖粗酶液，46 ℃水解1 h,用无水乙醇将其沉淀，干燥，pH值7.4)。刚果红-麦芽汁-CMC培养基：麦芽提取物30 ml、琼脂粉15 g、CMC-Na 5 g，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃、30 min灭菌，趁热加入1 ml刚果红，pH值5.5。2 试验方法2.1 粘均分子量测定壳聚糖分子量的测定方法有粘度法、蒸汽压渗透法、端基分析法和凝胶色谱法等。其中，粘度法是测定高聚分子量的一种常用方法[5]（粘度法测定方法为：将0.1 mol/l CH3COONa＋0.2 mol/l CH3COOH缓冲液用乌氏粘度计，于25 ℃时测定降解之前壳聚糖胶体的分子量，外推作图法计算粘均分子量M=106万Da)。2.2 纤维素酶的发酵通过用紫外线和Co60-γ射线对里氏木霉进行复合诱变,用CMC-刚果红作筛选培养基，筛选出透明圈直径与菌落直径之比大的菌株，接种到产酶培养基中作进一步复筛,选育出纤维素酶酶活较高的菌株,接种于固体培养基中,30 ℃恒温培养,每24 h测一次纤维素酶酶活。培养4 d时所测得的酶活为993.829 8 U/g,此时酶活最高。纤维素酶酶活的测定方法参照NY/T912—2004。2.3 甘露聚糖酶的发酵将短小芽孢杆菌接入一级种子培养基，37 ℃、180 r/min条件下培养48 h,得到甘露聚糖酶的粗酶液。将短小芽孢杆菌接入二级种子培养基，34 ℃、180 r/min条件下，每12 h测一次甘露聚糖酶酶活[6，7],48 h时所测定甘露聚糖酶活为456 U/ml,此时酶活最高。2.4 用不同酶制剂降解壳聚糖的比较分别采取不同的处理方式：①在10 ml的3％胶体壳聚糖溶液中加入1 ml甘露聚糖酶水解48 h(Ⅰ)；②在10 ml的3％胶体壳聚糖溶液中加入1 ml纤维素酶水解48 h(Ⅱ)；③