关于SOD肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性..docVIP

关于SOD：肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，ECl.15.1.1，简称SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，它催化超氧阴离子自由基·O2-发生歧化反应，从而清除·O2-。有氧生物体在生物进化过程当中，相应地进化成一套行之有效的清除活性氧的保护网络。植物体内有效清除活性氧的酶促解毒系统包括SOD、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、脱氢抗坏血酸酶(DHAR)等。SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞内过量的超氧阴离子自由基(·O2-)，它能催化植物体内分子氧活化的中间产物超氧物阴离子自由基的歧化反应，而生成氧分子和过氧化氢。生物体内的超氧阴离子(·O2-)是对体内重要生物大分子——脂类和蛋白质产生氧化和降解作用的一种有害物质，从而对细胞产生毒性。研究者于1938年首次从牛的血红细胞中分离出含铜离子的蛋白质(最初定名为血铜蛋白Hemocuprein)，并发现该蛋白有催化超氧阴离子自由基(·O2-)发生歧化反应的功能，因此命名为超氧化物歧化酶。 　　按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 　　改进的肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性 　　 　　一、 实验原理 　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在生物体内广泛分布，能催化超氧阴离子自由基(O2-.)发生歧化反应，从而清除氧自由基，起到防御氧毒、抗辐射、抗衰老等作用。 　　目前因SOD来源不同测活方法非常多，但是所测酶活结果相差较大、活性单位也不统一。因此，本方法是针对植物型SOD对肾上腺素自氧化法的各种影响因素进行了研究, 建立一种微量、快速、稳定重复性好且适用于植物来源的S O D测定方法。 　　因植物来源的SOD成分比较复杂，且有微量的多酚抗氧化物成分。肾上腺素是多酚衍生物，在碱性条件下会自动氧化，其中涉及到(O2-.)的链式反应，可被SOD抑制，肾上腺素经多步转化为肾上腺素红。肾上腺素红有480 nm和320nm两个吸收峰。325 nm处的吸收更能灵敏地反映自氧化程度。当pH10.2，线性范围缩短，pH值越高线性范围越小;pH10.2 时吸光度值极小，易带入误差。pH10.2 维持着良好的线性段，而且斜率适中，可作为实际应用中的最佳pH。温度在30℃左右，线性关系较好。随着肾上腺素浓度的增加，自氧化速率增大，线性范围增加，当肾上腺素浓度为0.4 mmol/L使每1 min自氧化速率达0.070，提高了灵敏度、减少了误差。 　　二、 实验材料及用具 　　1、实验试剂 　　植物SOD样品(串叶松香草提取)1g、pH 7.5 质量浓度0.05mol/ L 的磷酸钠缓冲液、丙酮、0.4mmol/L肾上腺素溶液、50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、100mmol/L盐酸液，内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠 　　2、实验器具 　　试管30ml、WFZ UV-2100 型紫外可见分光光度计、501A型超级数显恒温水浴、PHS-3C精密pH计 　　三、 实验步骤 　　1、配置溶液：配置pH 7. 5 质量浓度0. 05mol/L的磷酸钠缓冲液、50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液及0.4mmol/L肾上腺素溶液(62:38); 　　2、植物SOD样液的制备。将植物SOD样品,加入pH7.5质量浓度0.05mol/L的磷酸钠缓冲液,于4℃条件下3500转/min 离心15min ,取酶液,加入- 20℃预冷丙酮,取沉淀物溶于少量重蒸水中,pH7.5、质量浓度25mmol/L的磷酸钠透析即得酶的粗提液。 　　3、将配置好的50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液放到30℃±0.5℃水浴中保温20 min; 4、