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生物技术概论作业 200911202941 使用木糖发酵酒精代谢工程的研究【摘要】木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环，但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种。近年来，根据代谢工程原理，利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造，或将木糖代谢途径引入传统的酒精发酵菌酿酒酵母及高酒精产生菌运动发酵单胞菌中，从而拓展其底物利用范围；或使原本可以利用多种糖底物的细菌获得选择性产生酒精的能力，构建了各种不同类型的木糖发酵重组菌株。虽然这些重组菌株在木糖转化酒精方面均显示出良好的应用前景，但仍存在诸多问题。有必要在对木糖代谢调控机制深入系统研究的基础上，进一步改造现有菌株，并结合生化工程技术对重组菌株发酵条件进行优化，以实现高效生物转化木质纤维素原料制取乙醇。 【前言】 20 世纪70 年代的石油危机及当今世界对能源需求的急剧增长，加快了人们寻找开发燃油替代能源的步伐。作为传统的生物发酵产品和潜力巨大的燃料，乙醇已被公认为是最有发展前景的可再生清洁能源之一。从减少温室气体排放和环境保护角度出发，欧盟国家已建议生物燃料的使用到2005 年要占整个运输燃料消耗的2%，而到2010 年，这一数值要到达5.75%。我国2001 年就在大中城市中开始逐步推广使用乙醇汽油(乙醇占10%～15%)，这给燃料乙醇的开发及工业化生产带来前所未有的发展机遇。传统的乙醇发酵生产主要以淀粉质和糖蜜为原料，原料成本在生产总成本中占有很大的比例，在一定程度上限制了整个乙醇工业的发展。 与淀粉质原料不同，木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源，每年的总产量约占所有生物质资源的50%，目前大多数此类物质没有得到很好的利用。 因此，利用木质纤维素为主的可再生生物质资源，生产可再生能源具有重要的经济与社会意义。 木糖是半纤维素的主要组成单糖，在植物纤维材料水解液中含量可达到30%，可以说木糖的有效利用是生物质资源成功工业化转化的关键。对自然界可以利用木糖的微生物代谢途径研究分析发现，木糖进入菌体细胞后首先在木糖还原酶(XyloseReductase, XR)和木糖醇脱氢酶的作用下转化为木酮糖。在某些细菌中,木糖异构酶(Xylose Isomerase, XI)可以直接将木糖转化为木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶(Xylulokinase, XK)磷酸化生成5?磷酸木酮糖后可以进入磷酸戊糖途径(PPP)，最终以中间产物6?磷酸葡萄糖和3?磷酸甘油醛进入糖酵解途径生成酒精。 传统的用于乙醇发酵生产的微生物(酿酒酵母和运动发酵单胞菌等)能很好地利用葡萄糖，且乙醇发酵率高，乙醇耐受力强，但均缺少利用木糖的能力。因此，从20 世纪80 年代开始，人们便尝试利用代谢工程手段改造酵母菌或细菌来发酵木糖等五碳糖生产酒精，并取得了很大进展，获得了不少具有应用前景的工程菌株。本工作将介绍以酿酒酵母和细菌为初始菌株进行酒精代谢工程改造的研究进展。一、酵母菌的木糖代谢工程改造对酵母菌的木糖代谢改造主要集中在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，菌种改造涉及木糖跨膜运输、吸收利用、磷酸戊糖途径、糖酵解及胞内氧化还原状态的维持等多个方面。1、木糖运输木糖的跨膜运输被认为是酿酒酵母和树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)利用木糖最主要的障碍之一。在酿酒酵母中，木糖的吸收主要是通过高亲和力葡萄糖运输因子HXT4, HXT5, HXT7 和Gal2 介导进行的，因此，葡萄糖的存在可以强烈抑制木糖发酵酵母菌株对木糖的吸收。Hamacher 等研究发现，当酵母菌自身所有18种单糖运输因子被去除后，即使含有完整木糖代谢。途径的酵母工程菌也不能在含木糖的培养基上生长，说明木糖在酿酒酵母中的跨膜运输依赖于葡萄糖运输系统。对天然利用木糖的Pichia stipitis 研究发现，它含有两个动力学性质完全不同的木糖运输系统，其中低亲和力的运输系统为木糖和葡萄糖所共享，而高亲和力的运输系统却是木糖特异性的，但这种运输系统的性质还未被最终确定。相信对此新运输系统的深入研究将有利于提高目前酿酒酵母木糖代谢工程菌对木糖的高效利用。2、木糖向木酮糖的转化及磷酸戊糖途径改造 早在1991年，Kotter 等将树干毕赤氏酵母的木糖还原酶(XYL1)与木糖醇脱氢酶(XYL2)转移到酿酒酵母中使其表达，得到的酵母转化子可以在有氧条件下利用木糖并产生木糖醇。但研究发现，XYL1 与XYL2 相对表达水平的变化可以影响最终代谢产物的形成；随着XYL2 表达量的进一步提高，则会导致木酮糖的累积分泌，从而显示在这些转化重组酵母中，木酮糖激酶的活性在一定程度上成为木糖代谢的限速步骤。 木酮糖激