【2017年整理】生理指标测定实验方案汇总.docVIP

预测指标：1.抗氧化酶系统、MDA2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基3.叶绿素、类胡萝卜素4.可溶性糖5.游离氨基酸6.过氧化氢7. 谷胱甘肽、ASA1. 抗氧化酶系统、MDAA 酶活测定试剂：PBS缓冲液0.05M（pH 7.8）：取0.663g NaH2PO4·2H2O和16.384g Na2HPO4·12H2O，加PVP10g，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM，加蒸馏水定容至1L。样品制备鲜样0.1-0.5g加入1 ml磷酸缓冲液（0.05M，pH 7.8），稍许石英砂，研磨成匀浆；移入10 ml离心管中，再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中；10000×g 4℃下离心20 min；上清夜贮于4℃冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份(SOD （λ=560nm）试剂配制：1LPBS缓冲液中加入Met1.93973gNBT [氮蓝四唑]0.061323gEDTA-Na20.0037224g核黄素0实验步骤：2.725mL反应液＋250uL蒸馏水＋25uL酶液 【样品管】2.75mL反应液＋250uL蒸馏水（光照作为100%CK） 【照光对照管】2.75mL反应液＋250uL蒸馏水（黑暗作为调零） 【空白调零管】4000lx日光灯下反应20分钟，560nm比色。反应温度25~35℃已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示按下式计算SOD活性：SOD总活性＝（Ack－AE）*V/（0.5*Ack*w*Vt）（式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液的总体积ml，Vt为测定时样品用量ml，w为样品鲜重g）※※※【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。【样品管】和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。POD （λ=470nm比色）试剂配制：1.5%愈创木酚（1.5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100 ml）300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ul愈创木酚+100ul H2O2，于普通比色皿，轻轻摇匀2-秒，A470动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：POD(mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)A反应液总体积/ml；V提取液总体积/ml；a测定液体积/ml；w材料鲜重/g；E吸光系数/mM·cm-1CAT（240nm比色）试剂配制： 300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A240动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：CAT (mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)APX（λ=290nm比色）试剂配制： 7.5mM的抗坏血酸(AsA)：66mg AsA用蒸馏水定容到50 ml；300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A290动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：CAT (mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)B.丙二醛（MDA）含量的测定（λ=450，532，600nm比色）试剂配制：5%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸定容到500mL。MDA反应液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5%三氯乙酸定容到500mL。实验步骤：0.5mL酶液＋2.5mL反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm离心10分钟，上清转入新管，波长450,532和600下比色，MDA反应液调零。结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1）＝（D532－D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w）式中A为反应液总量（mL）；V为提取液总量（mL）；a为测量用提取液量（mL）；w为材料鲜重（g）。1.55×10-1为丙二醛的umol/L消光系数（nmol/mL消光系数）或者：MDA浓度(umol/L)=6.45(D532－D600) －0.56D450丙二醛含量（umol.g-1）= MDA浓度×提取液总体积(ml)/组织鲜重(g)/1000----------植物体可溶性蛋白质含量测定比色原理：染料考马斯亮蓝G-2