抗氧化活性测定方法..doc

总黄酮测定方法 仪器与设备： 1. 恒温混匀仪BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司) 2. 移液枪 (p1000, p200) 3. 分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220 日本岛津） 4. 15×150 mm 玻璃试管 5. 具塞玻璃试管, 10 mL 6. 容量瓶, 1000, 100, 10 mL 7. 紫外-可见分光光度计 （UV-1800 日本岛津） 试剂： 硼氢化钠 (成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯, ≥97.0%) 避光干燥保存。 三氯化铝 (天津博迪化工股份有限公司，AlCl3·6H2O, FW 165,分析纯，晶体, ≥99.0%) 四氯苯醌 (FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海，FW245.88 ≥98%,分析纯) 乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂，FW46.07，无水乙醇, ≥99.7%,分析纯) 四氢呋喃 (THF) (广东广华科技股份有限公司，FW 72.11，≥99.0%,分析纯) 冰乙酸 (成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯) 盐酸 (成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯) 槲皮素 (国药集团化学试剂有限公司，FW302.24, ≥ 98%, 生化试剂 BR) 香兰素 (天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, ≥ 99.0%,分析纯) 试剂配制： 1. 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液，溶剂为四氢呋喃：乙醇（THF:EtOH）=1:1。 配制10 mM 槲皮素标准溶液：准确称取 151.12 mg槲皮素，用上述溶剂定溶至50mL容量瓶。 2. 50.0 mM NaBH4 乙醇溶液： 称取189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解，定容100mL容量瓶。(不宜长期保存; 松开盖子以防炸裂) 3. 74.6 mM AlCl3 6H2O乙醇溶液 (含有 1% H2O) 称取 1.80 g AlCl3 6H2O, 1 mL 水溶解，加入适量无水乙醇，后定容100mL容量瓶(储存防潮)。 4. 20.0 mM 四氯苯醌四氢呋喃溶液 称取 491.8 mg四氯苯醌, 四氢呋喃（THF）溶解定容100mL. 5. 0.8 M 冰乙酸溶液 称取 4.84g冰乙酸, 蒸馏水定容100mL. 16% (w/v, 1052 mM) 香兰素甲醇溶液 称取 16.0 g 香兰素, 甲醇定容100 mL. 操作步骤： 1. 用移液管准确移取0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0mL配置好的10Mm槲皮素标液于10mL容量瓶，用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液定容。 用移液枪移取槲皮素各浓度梯度标液1mL或者花椒叶各相浸膏稀释样液（5mg/mL）1mL于玻璃试管中（样液必须现配先用），空白采用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液1mL。 2. 含有1mL样液或者1 mL 槲皮素标液的试管中, 加 0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液，0.5 mL 74.6 mM AlCl3 溶液,后在室温下于红外转子摇床内摇30 min. 再加0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液，摇30min。 3. 加2.0 mL 冰的 (4 oC) 0.8 M 冰乙酸溶。避光，试管内溶液晃匀后，摇晃15min。 4. 加入1 mL 20.0 mM 四氯乙醌，后于红外转子摇床内，95 oC反应60min。 5. 反应完全后，自来水冷却。 6. 甲醇转出，至少两次，定容具塞试管于4mL刻度线处。 7. 加入1 mL 16% 香兰素甲醇溶液， 2 mL 12 M HCl 浓盐酸，混匀后室温 (20-25 oC)下避光保存15 min。 8. 于490nm下测定吸光度值，每个样液重复三次。 9. 数据处理。 总黄酮含量表示为: mmol槲皮素/g样品或者浸膏。数据为三组重复的mean ± SD 。 数据处理： 1. 标准曲线： 黄酮测定标曲制作原始数据： 槲皮素标准液浓度mM Abs1 Abs2 0 0.167 0.169 0.3 0.257 0.252 0.5 0.32 0.292 1 0.391 0.388 2 0.552 0.555 4 0.88 0.892 5 1.004 1.122 6 1.268 1.266 8 1.6 1.597 10 1.956 1.959 黄酮测定标曲制作原始数据的系统性描述 槲皮素浓度mM Mean St