【2017年整理】第八章 酶分子定向进化(提纲).docVIP

第八章酶分子定向进化一、酶分子定向进化的目的为什么要研究酶的定向进化?天然酶的局限性在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低存在产物抑制稳定性差，活性低，催化效率低有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。二、酶分子的改造酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计。酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计。问题：定向进化是不是定点突变？澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以 PCR 技术为基础的。什么是酶的定向进化?从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的1突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。酶分子定向进化研究的历史萌芽阶段：20 世纪 60 年代 Sol Spiegelman 利用 RNA 噬菌体 Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程奠基阶段：20 世纪 80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶分子的新思想发展阶段：20 世纪末期易错 PCR 和 DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟如何使酶分子定向进化?定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选三、酶分子定向进化的基本策略和方法定向进化的基本策略一般而言，定向的分子进化有三种方法：（1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含 1-2 有益突变的积累。（2）随机突变继之筛选两个或更多的改进的突变体重组，使有益突变组合并消除有害突变。（3）同源基因顺序重组(族改组) 产生功能嵌合蛋白质，并且允许一步完成许多有益突变的组合，包括非累加突变。定向进化的两个重要环节多样性基因文库的构建文库中所期望的进化酶的挑选定向进化的基本过程酶定向进化通常分 3 步进行：通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性导入适当载体后构建突变文库通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶定向进化的基本方法无性进化易错 PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变和随机寡核苷酸突变等有性进化DNA 改组（DNA shuffling）、外显子改组（exon shuffling）、随机引物体外重组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等。易错 PCR(error-prone PCR)技术为代表的无性进化2一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。通过改变 PCR 反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制 DNA 的突变频率。易错 PCR 技术的特点优点操作简便，随机突变丰富缺点正突变的概率低，中性突变较多，突变基因文库较大，文库筛选工作量大，一般适用于较小基因（800bp)连续易错 PCR(Sequential error-prone PCR将第一轮 PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复进行随机突变，使每一轮获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。e.g. 1993 年DNA 改组技术(DNA shuffling)为代表的有性进化又称 DNA 重排技术或有性 PCR，指 DNA 分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。分子育种DNA 改组技术基本过程：从两种以上同源正突变基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次 PCR 循环，使 DNA 的碱基序列重新排布而引起基因突变。3DNA 改组原理DNA 改组与常规定向进化的比较DNA 改组技术的特点优点正突变的概率较高、进化速度较快缺点需要利用 DNase I 随机切割，获得 DNA 随机片段，在进行无引物 PCR 获得全长突变基因之前，必须将 DNase I 去除干净，以免突变基因再被切割。改进 1：交错延伸