第七章化学检测技术研究报告.ppt

* 2、沉淀反应 可溶性抗原沉淀反应（precipitation）:可溶性抗原与相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。 包括：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋白分子等。 反应特点：比例性 包括：沉淀试验、界面试验、免疫扩散 （单向免疫扩散、双向免疫扩散）、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光 * 沉淀试验 界面试验 * * 3、免疫标记 免疫标记技术（immunolabelling technique） 用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的检测。 * 常用的免疫标记物质： 荧光素, 酶, 放射性核素 , 金属颗粒 具体检测分为 ：免疫荧光法、酶免疫测定 、 放射免疫测定法、化学发光免疫分析、免疫印迹法 * （1）免疫荧光法 免疫荧光法（immunofluorescence,IF）用荧光素与抗体连接成荧光素标记抗体，再与待测样品中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位 包括：直接荧光法、间接荧光法 * * * （2）酶免疫测定 酶免疫测定（enzyme immunoassay）：即将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助于酶作用于底物的显色反应判定结果。可以通过酶标测定仪测定光密度（OD）值，反应抗原含量，达到定量分析的目的。 * （3）放射免疫测定法 放射免疫测定（radioimmunoassay,RIA）:用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。 该法灵敏度高特异性强，常用于测定微量物质。 * （4）化学发光免疫分析 化学发光免疫分析： 用发光物质标记抗原或抗体，发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待测样品中抗原或抗体的含量。 * （5）免疫印迹法 免疫印迹法： 将抗原物质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分带后转至硝酸纤维素膜上，用酶标或放射性核素标记的抗体识别和结合抗原，加底物显色或做放射自显影显示结果。 * 思考题 1 如何区别还原糖与非还原糖？举出常见的还原糖与非还原糖。 2 有哪些定糖方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。 3 如何测定薯类淀粉含量？ 4 蛋白质含量测定有哪些方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。 5 如何用滴定法测定氨基酸含量？ 7如何用定磷法测定DNA或RNA含量？ 8 二苯胺测定DNA和地衣酚测定RNA原理？ 9 三瓶未知液分别为蛋白质、糖和RNA，如何鉴定？ * 第七章 化学检测技术 根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。 应用最早、最广泛的检测技术 简便、快速、操作容易 * 一 、 糖类的化学检测 糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖 多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定 * 最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂 基本组成： A：CuSO4溶液 B: NaOH和酒石酸钾钠溶液 使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜） 酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。 * 定糖常用方法 1、兰—爱农（Lane-Eynon）法 次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、 （置换法、直接滴定法） 反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失） 多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解 * 操作要点 （1 ）斐林试剂的标定 （a）标定预备试验 A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。 （b）标定 A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0 * (2) 定糖 （a）定糖预备试验 A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。 （