第一章PCR技术研究报告.ppt

3、基本方法： ①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。 ②蛋白酶K消化处理:用60μg/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。 ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。 ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。 ⑤显微镜观察结果。 固定剂（通常为甲醛固定剂如中性甲醛）：对组织或细胞进行固定； 蛋白酶K：细胞通透处理，确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触。 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 PCR和原位PCR在概念上的区别 PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应。 原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。 原位PCR实验主要的应用范围 （1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等； （2）观察病原体在体内分布规律； （3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等； （4）检测导入基因； （５） 遗传病基因检测，如β-地中海贫血。 原位PCR 1、LCR的基本原理： 利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。 2、应用 　 目前LCR主要用于点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。 （十二）连接酶链反应 (Ligase chain reaction，LCR) 　3、反应程序: 首先加热至一定温度下(94～95℃)使DNA变性，双链打开； 然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口； 如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物。 Ligase chain reaction (LCR) cDNA末端快速扩增技术是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5‘和3’末端的有效方法。 RACE可以分为两类： 5’ RACE-PCR 3’ RACE-PCR （十三）cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer, UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer, GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3 / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。  5’ RACE-PCR 利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。 3’ RACE-PCR （十四）AFLP（扩增性片段长度多态性 ） AFLP技术是