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研習報告與討論 Low Dose COX-2 Inhibitor (use Etodolac) and Arsenic Trioxide Have Additive or Synergistic Effect on Hep3B. 姓名：黃玫璇 學號：891672 研習地點：成大生化所 賴明德老師實驗室 一、實驗動機 發生在大腸的腫瘤癌症稱為結腸直腸癌(colorectal cancer)，包括盲腸(cecum)、結腸（colon）及直腸（rectum）。醫學研究報告指出結腸直腸癌是世界癌症死亡原因的第二大主因，其同時為我國最常見的惡性腫瘤之一，發生率居第3位。目前已有許多研究主題在測試結合兩種不同藥物對colorectal cancer cells是否有加成性的毒殺作用（synergistic effect），最終目的在應用於colorectal cancer臨床治療。在此實驗中，我們選擇了合併使用Etodolac(selective COX-2 inhibitor) 和arsenic trioxide(AS2O3)來測試其對人類結腸癌細胞是否有加成性的毒殺作用。 二、摘要 為了確保進行MTT assay實驗的準確性，在暑假的前段時間，主要重點落在cell culture上，選用的細胞株為Hep3B。在24-well plate上seeding 1×104 、5×104、10×104及15×104 cell number/ml的細胞數，作三重覆；但經測OD後發現：OD值在1×104和5×104兩種細胞數間有較大的躍遷(圖一)，於是在後來的記數細胞實驗中多增加一組2.5×104的數據。經過幾次實驗後(在此僅show出圖二)，已能準確的(R2＞0.98)計算出cell number/ml 和OD (at 540nm)間有明顯的線性關係(圖三)，於是作了Hep3B OD 540 vs. cell number/ml 的Standard Curve(圖四)；供於日後欲細胞定量時使用。 接著進行MTT assay，所採用的細胞株為Hep3B和chang liver。本來預定作出：「單獨一種藥物(Etodolac only and AS2O3 only)對此兩細胞株個別的cell killing curve」。我以Hep3B和chang liver作為單獨使用Etodolac時的target cell lines：對Hep3B加以濃度為0、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.0( mM )的Etodolac得圖五的柱狀圖，但發現細胞的毒殺曲線並未被明顯拉出，因此多增加2.0、3.0兩種劑量以拉出cell killing curve(圖六)；對chang liver同樣施以0、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 ( mM )的Etodolac，得圖七柱狀圖和圖八cell killing curve。因為後來Hep3B細胞株的生長情形不佳，故僅以chang liver作為單獨使用arsenic trioxide作用時的target cells，對其施以濃度0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、8.0、10.0 (μM )的 AS2O3，得圖九柱狀圖及圖十cell killing curve。此後依舊使用chang liver來作Combination Assay：求得反應時間分別為48h、72h時的OD540(表一、二)，以未加任何劑量藥品時的細胞數為100％，作細胞存活數目和藥物劑量的關係圖(圖十一)，再代入chang liver cells「OD540 vs. cell number/ml 的Standard Curve」，則可得知：「合併使用多種不同劑量的Etodolac和AS2O3對人類直腸癌細胞的毒殺數目的影響(additive, synergistic or no effect)」；當我們繼續嘗試各種濃度的Etodolac和AS2O3劑量後，就能測試出「合併使用某特定劑量的Etodolac和AS2O3時，比單獨使用Etodolac或AS2O3，對人類結腸癌細胞有最佳的毒殺作用」，再經一連串的臨床試驗後，或許能開啟人類結腸癌治療的另一扇窗。 三、背景介紹 1.cycloxygenases (COXs) cyclooxygenase(COX)催化arachidonic acid合成prostaglandin(PGs)。其有兩種形式(isoforms)：COX-1和COX-2(見附表)。COX-1為housekeeping gene，在正常的生理情況下即可在多處組織內持續的被表現；而COX-2則是在發炎反應、mitogen、oncogen