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免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原Experiment25
【实验目的】 了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原 Experiment 25 【实验原理】 用人结肠癌细胞为免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原(Ag)的单克隆抗体 IgG(第一抗体)，二者可以发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入市售(也可自制)的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体(第二抗体)，可以与复合物进一步发生抗原抗体反应(二次抗体反应)，这样就可以在荧光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表面的存在 【实验材料】 一、材料和标本：人体结肠癌培养细胞、HeLa细胞、小鼠抗人结肠癌细胞抗体(第一抗体)、荧光标记羊抗鼠抗体（第二抗体）。 二、器材和仪器：盖片、载片、培养瓶、培养皿、滤纸、镊子、吸管、普通倒置显微镜，荧光显微镜、微量加样器。 三、试剂：1640培养液(加lO％小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液体石蜡。 【实验内容】 1．将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中，培养2～3天。 2．在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后，在盖片左上角用玻璃笔做一下标记，以免在以后的操作中正反面颠倒。 3．将盖片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分钟。 4．用PBS洗三次，注意不要将PBS液直接倒在盖片的细胞面，以免引起细胞大量丢失。用滤纸片将盖片上的PBS轻轻吸干，不要损伤细胞层。 5．将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上．每个盖片50μl，37℃温育30分钟。 6．用PBS洗三次，滤纸吸干。 7．将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体5μl滴加在盖片上，37℃温育30分钟。 8．用PBS洗三次，滤纸吸干。 9．将载片上滴一滴液体石蜡。然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上，在荧光显微镜下观察。 【实验结果】 细胞多成团块状存在，细胞膜表面显示黄绿色荧光，细胞内及背景均不发光。每组应设立一个阴性对照组，以培养的HeLa细胞为抗原，操作步骤相同。 【作业与思考题】 1．三次用PBS清洗的目的各是什么？ 2．为排除荧光标记的羊抗鼠抗体直接与人结肠癌细胞表面某种抗原发生反应的可能性，你认为还应设立什么样的对照组?
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