DNA重组工技术的原理及步骤.ppt

DNA重组技术的原理及步骤 第五组：郑桂贤 一、发展历史 1951年，美国学者E．莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。 20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA?限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。 二、DNA重组技术的原理 1.目的基因的获取 2.克隆载体的选择与构建 3.外源基因与载体的连接 4.重组DNA导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达 三、 DNA重组技术的步骤 1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体 Recombinant DNA Technology ①从细胞中分离出DNA ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ②限制酶截取DNA片断 ③分离大肠杆菌中的质粒 ④ DNA重组 ⑤用重组质粒转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌克隆大量基因 ⑦重组体的筛选 （一）分：目的基因的获取  1. 化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物 、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变 2. 基因组DNA 、cDNA 3. 聚合酶链反应 cDNA文库 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 克隆载体的选择和构建  理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性 常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。 pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 质粒载体 （二）切：对目的基因和载体适当切割 （1）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 （三）接：目的基因与载体连接 (三) 连接策略 1. 粘端DNA 间的连接 (1) 同一限制性内切酶切割位点连接 (2) 不同限制性内切酶切割位点连接 2. 平端DNA 间的连接 3. 同聚物加尾连接 4. 人工接头连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 同聚物加尾连接 （四）转：重组DNA转入受体菌 ? 无性繁殖 ? 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态. ? 方式: 转化、转染、感染 导入大肠杆菌 ? 导入哺乳动物细胞  （五）筛：筛选出含有重组体的受菌体  直接选择法 间接筛选法 核酸水平 蛋白质水平 1. 抗药性选择 *1. 酶切图谱 免疫学的技术： *2. 核酸探针 SDS、 2. 标志补救 *3. PCR